[Venezuelcu eguine encephalomyelitis (VEE) (англ.); Venezuelische Pferdenzephalomyelitis (нем.)]
Венесуэльский энцефаломиелит лошадей (ВЭЛ) — остро протекающая болезнь однокопытных, характеризующаяся поражением ЦНС, желтушностью слизистых оболочек и резко выраженным нарушением деятельности ЖКТ Болезнь распространена в странах американского континента.
Впервые вирус выделили из мозга лошадей Вир и Виков (1938 г.) в Венесуэле.
Морфология и химический состав. Размеры вирионов в ультратонких срезах 25—45 нм, во взвеси — 80 нм. Обнаружены и более мелкие (16 нм) вирионы, которые считают субъединицами вируса. Вирионы имеют спиральный тип симметрии. Длина спиральных нитей до 400 нм, шага спирали 6 нм и диаметр 7,5 нм. При центрифугировании вируса в градиенте плотности виннокаменнокислого калия получено три фракции: 1-я плотностью 1,2 г/см3 содержала интактные частицы вируса; 2-я плотностью 1,17 г/см3 имела высокий титр ГА, но слабовыраженную гемолизирующую и инфекционную активность; 3-я плотностью 1,24 г/см3 обладала высокой инфекционной и ГА-активностью. ГА имеют форму полого цилиндра длиной 5,5—6,0 нм и диаметром 4,0—4,5 нм. Рибонуклеопротеид представляет собой тяж толщиной 1,5—1,7 нм. Предполагается, что он упакован внутри вириона таким образом, что петли наружной части нуклеоида взаимодействуют друг с другом, как капсомеры при кубическом типе симметрии. Это и определяет квазиикосаэдрическую форму нуклеоида. Размер вирионов 72—86 нм. Кроме белка, в состав входит до 60 % липидов и 3,9—6,2 % РНК. Геном вируса состоит из одноцепочечной (+)РНК с 5'-КЭП-структурой и З'плай (А) последовательностью. После проникновения в клетку, РНК транслируется с образованием неструктурных белков, необходимых для амплификации геномной РНК и последующего синтеза субгеномной 26S РНК, которая является матричной для синтеза структурных белков. Получены рекомбинатные штаммы вируса, экспрессирующие ген PRES1-S вируса гепатита В.
Вирус сохраняется при -70 °С, в 50 %-ном глицерине и лиофилизированном виде. Инактивируется формалином. Гидроскиламин оказывает сильное инактивирующее дейтвие. При облучении вируса ВЭЛ в дозах от 8106 до 16-Ю6 рад удаётся получить инактивированный АГ, обладающий ГА активностью в 4 раза ниже по сравнению с нативным вирусом, но равноценный в АГ отношении. При обработке очищенного вируса тритоном Х-100 можно отделить компоненты суперкапсида от капсида. Суперкапсиды неинфекционны, иммуногенны, вступают в РГА, РЗГА, РСК и РН. Инфекционная активность вируса ВЭЛ утрачивается после обработки его Твином-80, а гемолизирующая — после воздействия эфиром. Изучено действие УФ и лазерного излучения на вирус ВЭЛ.
С помощью иммуноэлектрофоретического фракционирования АГ вируса ВЭЛ удалось выделить две фракции: 1 включает поверхностные мембранные АГ, идентичные ГА; 2 содержит гемолизирующий АГ. В составе вирионов ВЭЛ обнаружено три белка: белок нуклеокапсида (мол. м. 59000-61000 Д), белок ГА (34000-38000 Д) и белок базальной мембраны (15000—18000 Д). АГ-структура определяется поверхностными гликопротеидами Е1 и Е2. С помощью монАТ в АГ-структуре гликопротеида Е2 выделено восемь эпитопов связывания монАТ на белке Е2, четыре из них связаны с нейтрализацией или торможением гемагглютинации и объединены на основе функциональной активности в ВН-сайт гликопротеида Е2.
Разумов И. А. и др. создали коллекцию из крысиных гибридом, секретирующих монАТ к вирусу ВЭЛ. С их помощью изучена АГ-структура вируса и показана схожесть АГ структуры двух вакцинных штаммов вируса ВЭЛ (ТС-83 и 230). Далее ими же была изучена структура и функция белка Е1, показано сходство трех штаммов вируса ВЭЛ: Тринидад, Т-83 и 230. У аттенуированного шт. ТС-83 выявлена замена одной аминокислоты в Е1, 5 аминокислот в Е2 и делеция в 3'-концевой некодирую-щей области генома.
Структурные гликопротеиды вируса ВЭЛ играют важную роль в формировании противовирусного иммунитета, вызывая появление нейтрализующих анти-ГА и про-тективных AT. С помощью монАТ к вирусным гликопротеидам Е1 и Е2 была изучена их полная АГ-структура, выявлены и картированы эпитопы, определены функции отдельных АГ-детерминант, впервые предложена карта взаимного пространственного расположения эпитопов на гликопротеиде У2 вируса ВЭЛ и выявлен «критический сайт», ответственный за формирование ВНА и протективных AT. В результате было установлено, что белок Е1 вируса ВЭЛ содержит не один, как это было известно ранее, а по крайней мере два протективных эпитопа.
У переболевших животных обнаружены ВНА, КСА и анти-ГА. ВНА появляются на 6-й день после заражения, КСА и анти-ГА — позже. У КРС появляются ВНА и анти-ГА. Сыворотки, полученные на компоненты суперкапсида, защищают мышей от летальной вирусной инфекции. Иммунизация мышей суперкапсидом сообщает им иммунитет против вирулентного вируса. Обсуждается перспектива использования компонентов суперкапсида вируса в качестве вакцины. Показана возможность выявления AT к ВЭЛ в ELISA с применением очищенного в водно-полимерной системе АГ(5,6).
Антигенная вариабельность и родство. Вирусы комплекса ВЭЛ в АГ-отношении разделены на четыре группы или подтипами: первая группа содержит семь вариантов, из них четыре высокой вирулентности; остальные три группы имеют по одному варианту с низкой вирулентностью. Вирус ВЭЛ дает перекрестные реакции с другими альфавирусами в РЗГА. Его можно легко дифференцировать от других вирусов с помощью РСК и РН. На основании опытов перекрестной резистентности иммунизированных животных выявлена близость вируса ВЭЛ к варианту вируса ВАЭЛ. Вирус разделяют на подтипы по спектру патогенности: вирулентный для хомяков шт. ВеА8 {подтип 3), невирулентный для хомяков шт. ВеА35645 (подтип 4), вирулентный шт.63И2 (подтип 1), аттенуированный ТС83 вакцинный шт. (подтип 1, вариант А) нестабильный по патогенности для хомяков. Вирус ВЭЛ с 1930—1940 гг. изменил свои свойства, поэтому для изготовления инактивированной вакцины используют вновь выделенные эпизоотические штаммы.
Вирусы Мукамбо, Tonate и НД-1252 классифицированы как варианты Ш-А, Ш-В и Ш-С соответственно. Вирус Callassan, который не связан тесно с изолятами комплекса, относится к новому подтипу V (17).
Гемагглютинирующие свойства аналогичны другим альфавирусам А. ГА-антиген обнаружен в мозге зараженных мышей после удаления ингибиторов в жидкой фазе тканевых культур. Оптимум рН для РГА 5,8—6,0. По мере снижения концентрации эритроцитов чувствительность РГА возрастает. Используя методику H7VHPH Характер Адсорбции вирионов на эритроцитах гусей. У больных лошадей вирус выделяется со слизью носа, секретами глаз, слюной, мочой и молоком, поэтому возможен контактный путь распространения болезни. У экспериментально зараженных лошадей вирус обнаруживают в носовых, ротовых и конъюнктивальных смывах, в крови, почках, мозге. В отличие от ЗАЭЛ и ВАЭЛ при ВЭЛ вирус обнаруживают в крови животных в высоком титре, что способствует инфицированию большого числа москитов, питающихся кровью больных животных. Два штамма вируса ВЭЛ, принадлежащих к подтипу 1, вызывали виремию у поросят и КРС продолжительностью от 0,5 до 3 дней. В крови птиц титр вируса невысокий. Поэтому предполагают, что естественным резервуаром вируса, по-видимому, являются млекопитающие, а не птицы.
Экспериментальная инфекция. Вирус ВЭЛ более патогенен для лабораторных животных, чем вирусы ЗАЭЛ и ВАЭЛ, и инфекция у них легко воспроизводится при периферическом заражении. Титр вируса в мозге лабораторных животных достигает 1010 ЛД 5о/m1. Инкубационный период продолжается 1—3 дня. Помимо экстраневраль-ных путей заражения, инфекция воспроизводится и при заражении через органы дыхания. У зараженных животных вирус обнаруживают в мозге, крови, слизи носоглотки и в фекалиях. Вирус высоко вирулентен для КЭ 9—11-дневного возраста. При заражении лошадей эпизоотическими штаммами наблюдается высокая температура, резко выраженная лейкопения и симптомы энцефалита.
Кроме лошадей, к экспериментальному заражению восприимчивы собаки, кошки, овцы и козы. Последние являются индикатором активности вируса. При заражении их минимальной дозой, передаваемой одним комаром, ВНА и анти-ГА появляются через 6—9 дней после заражения. Титры их быстро возрастают. КРС невосприимчив. Птицы заболевают при заражении в больших дозах. Зараженные голуби имеют в 60—80 % случаев ВНА в высоком титре. Присутствие вируса в ротовой полости голубей, зараженных подкожно, свидетельствует о возможности передачи вируса ВЭЛ респираторным путем. Имеется сообщение об экспериментальном заражении мышей посредством ингаляции. Вирус ВЭЛ вызывает летальный энцефалит у мышей. Дикий тип вызывал 100 % летальность у мышей, зараженных интрацеребрально и в подушечку лапки. Мутант вируса 209 был апатогенен при заражении мышей в лапку, но вызывал 100 % гибель при интрацеребральном заражении.
Удавалось инфицировать также коров шт. MF-8. Симптомов болезни не наблюдалось, но в сыворотке крови обнаружены специфические AT. У белых крыс при респираторном заражении первоначальное размножение происходит как в верхних, так и в нижних участках дыхательного тракта. Заболевание сопровождается рядом выраженных клинических проявлений. Животные были малоподвижны, лежали или сидели съежившись, не перемещались в клетке даже под действием сильных раздражителей, отмечалось кровотечение из носа, парезы или параличи конечностей, животные практически не ели. Развитие заболевания сопровождалось вирусемией, инфицированием многих органов лимфомиелоидной системы, а также обонятельного тракта и головного мозга.
На поздней стадии инфекции у аэрозольно зараженных белых крыс в сыворотоке крови появляются ВНА. ВВЛЭ реплицируется в лимфоидных тканях после периферической инокуляции. Энцефалит развивается после проникновения в ЦНС из крови. Раннее поражение выявляется в нервной системе через обонятельный нерв. После аэрозольного заражения вирулентным ВВЛЭ вирус реплицируется в слизистой оболочке носа, после чего проникает в обонятельный нерв, заражая нейроэпителиальные клетки.
Культивирование. Вирус ВЭЛ легко размножается на КЭ, в культуре клеток почки некоторых приматов, фибробластов КЭ, почки морской свинки и хомячков, уток, обезьян, овец, перевиваемых клеток L (мышиных). Размножаясь в диплоидных клетках человека (W1—38), он вызывает ЦПИ. В культуре клеток L развивается хроническая инфекция. В культуре клеток КЭ, Hela и клеток сердца морской свинки вирус атте-нуируется настолько, что становится авирулентным для морских свинок, кроликов и взрослых мышей, зараженных периферически. Аттенуированный вакцинный штамм вируса ТС-83 получен в результате 45 пассажей вирулентного штамма в культуре клеток сердца морской свинки. Аналогичный штамм-15 получен серийным пассированием в культуре клеток КЭ.
Апатогенные клоны образуют в тканевой культуре мелкие бляшки, патогенные — более крупные. При введении мышам они размножаются в печени и селезенке, симптомы болезни не проявляются. Популяция вируса неоднородна, так как, помимо апа-тогенного, обнаруживаются патогенные клоны вируса. При серийном пассировании на мышах вирулентность аттенуированных вариантов восстанавливается.
В инфицированных клетках образуются псевдовирусы, представляющие собой комплекс вирусной РНК с клеточным белком, что играет важную роль в возникновении и поддержании вирусоносительства. Будучи нечувствительными к вирусспеци-фическим AT и обладая инфекционностью, псевдовирусы легко преодолевают иммунные барьеры организма и долго персистируют в клетках.
Вирионы формируются, по-видимому, на мембранах, окружающих цитоплазмен-ные вакуоли, затем достигают поверхности клетки и выделяются из нее. Каждая клетка продуцирует приблизительно 2700 бляшкообразующих единиц. При культивировании в культуре фибробластов КЭ зрелые вирионы формируются на мембранах внутриклеточных вакуолей. Найдены олиго - и полигеномные формы вирионов. Вирус ВЭЛ инкорпорирует в своей структуре АГ клеток, в которых он репродуцируется. У высокоочищенного вируса, выращенного в культуре куриных фибробластов, найдены видоспецифический АГ, гетерогенный АГ Форссмана и групповые АГ А и Н. Эти АГ локализованы у вируса неодинаково: видовой — поверхностно, групповые и гетерогенный АГ Форссмана — более глубоко. Изучен процесс прикрепления вирионов аттенуированного шт. ТС-83 вируса ВЭЛ к макрофагоподобным клеткам липомы BW-J-M. Показана специфическая природа гликопротеидных рецепторов клеток, ответственных за прикрепление вируса.
Гликопротеид Е2 вирулентного вируса (TRD) содержит три участка гликозилиро-вания, тогда как гликопротеид Е2 вакцинного вируса (ТС-80) — только два. Описаны линии клеток-помощников, пермиссивные для альфавирусов (АВ) и экспрессирующие инфекционные, дефектные по репликации частицы АВ. Клетки-помощники содержат две РНК-помощницы, каждая из которых экспрессирует лишь часть структурных белков АВ, но вместе эти РНК поставляют полный набор структурных белков АВ, обеспечивающий сборку вирионов АВ. В клетки-помощники вводится реплико-новая РНК, содержащая последовательность упаковки АВ и встроенную гетерологичную РНК. Описаны конструирование репликона вируса венесуэльского энцефалита лошадей (ВВЭЛ) и встраивание в этот репликон гена гемагглютинина вируса гриппа, гена зеленого флуоресцентного белка либо генов белка N или гликопротеина оболочки вируса лихорадки Ласа.
Осуществлена идентификация и функциональный анализ клеточных генов, дифференциально экспрессирующихся в результате инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей. Сконструированы химерные вирусы венесуэльского энцефаломиелита (ВВЭЛ) VE/IAB-Ie, несущий неструктурные гены эпизоотического варианта LAB ВВЭЛ, и IE IE/IAB, неструктурные гены IA и структурные гены IAB. Эти химерные ВВЭЛ образуют бляшки промежуточного размера между размерами бляшек родительских штаммов. Оба химерных вируса проявляют также промежуточные уровни репликации и вирулентности для морских свинок. Однако ВВЭЛ 1Е/1АВ вызывает более высокую виремию и более быструю гибель, чем VE/IAB-1A. По чувствительности к интерферону только VE/IAB-IA IAB занимает промежуточное положение между родительскими штаммами. Вторая химера IA/IAB в 5 раз более чувствительна к интерферону, чем родительский IE, и в 50 раз чувствительнее, чем родительский штамм ВВЭЛ IAB. Эти данные показали, что структурная и неструктурная части генома ВВЭЛ вносят вклад в эпизоотический фенотип ВВЭЛ и что эпизоотические варианты могут возникать из энзоотического ВВЭЛ IE.
Естественный резервуар вируса неизвестен, предполагают, что это птицы. Переносчиками вируса могут быть Aedes taeniorhynchus и Mansonia titillans. В США вирус ВЭЛ изолировали из Aedes sollicitans, Psorophora confinnis, Psorophora discoler. Возможно заражение лошадей путем контакта. В Мексике вирус выделен от хомяков и комаров рода Culex, а в южной части Флориды — от комаров Culex, полевых мышей и хлопковых крыс. Дискутируется вопрос о роли КРС как естественного резервуара вируса, поскольку в местности распространения ВЭЛ AT обнаружены у КРС, свиней и собак. Собаки могут участвовать в эпизоотическом распространении инфекции.
В лабораторных условиях мокрецов семи видов p. Culicoides, собранных в естественных условиях в одном из районов ЮАР, заражали вирусом энцефалита лошадей серотипа Bryanston, распространенным в естественных условиях в ЮАР. Мокрецов заражали путем кормления кровью, содержавшей указанный вирус. В случае мокрецов Culicoides (Avaritia) imicola через 10 дней после заражения составила 22,3 %, причем интенсивность заражения в течение 10 дней, по данным титрования, возросла в 2—3 раза, что свидетельствует о развитии и размножении вируса в мокрецах этого вида. У мокрецов всех остальных использовавшихся в работе видов зараженности вирусом не выявлено. Полученные результаты позволяют предполагать, что мокрецы С.(A.) imicola могут служить переносчиками указанного вируса в естественных условиях ЮАР
Изучали способность перуанских комаров служить переносчиками эпизоотического и энзоотического штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Комаров собирали в бассейне Амазонки в Перу и исследовали на восприимчивость к энзоотическим и эпизоотическим штаммам вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ). Комаров заражали путем кормления на зараженных вирусом ВЭЛ хомячках. Высокая степень восприимчивости ко всем штаммам (степень заражения более 87 %) наблюдалась в случае комаров Culex (Melanoconion) gnomatus. С.(М.) vomerifer и Aedes fulvus. У комаров Psorophora albigenu. Mansonia indubitans и М. titillans отмечался средний уровень восприимчивости также ко всем штаммам (степень заражения 50—86 %). Все они также передавали вирус ВЭЛ через укус. Комары P. cingulata и Coquillettidia venezuelensis были восприимчивы ко всем штаммам, но не передавали их через укус даже после интраторакального заражения, что свидетельствует о наличии у них какого-то барьера на уровне слюнных желез. Комары Сх.(Сх.) coronator и Сх.(М.) pedroi оказались абсолютно устойчивыми к заражению всеми штаммами вируса ВЭЛ.
Для окончательного определения основных переносчиков вируса ВЭЛ в естественных условиях необходимо изучение экологии, динамики численности, особенностей питания и распространения отдельных видов комаров. Изучены особенности миграции комаров из лесного очага венесуэльского лошадиного энцефалита (ВЛЭ) для определения видов, потенциальных разносчиков вируса ВЛЭ за пределы очага. Критериями для определения таких видов служили: их распространение как в лесу, так и на прилежащих территориях, питание на широком круге позвоночных хозяев, возможность миграции на большие расстояния, доказанная возможность служить переносчиком вируса ВЛЭ. В дневное время на открытых участках комары практически не отлавливались и разнос вируса за пределы очага, вероятно, происходит только в ночное время. По указанным критериям потенциальными разносчиками вируса ВЛЭ за пределы очага можно считать комаров Culex nigripalpus, Aedes scapularis и Mansonia titillans.
В естественных условиях заболевают лошади, ослы, мулы и люди. Симптомы энцефалита отмечают не у всех инфицированных лошадей и ослов. У некоторых регистрируют только лихорадку, состояние угнетения и диарею. На юго-востоке Мексики сыворотки КРС и свиней содержат AT к ВЭЛ. Видимо, эти животные также участвуют в циркуляции вируса, передаваемого комарами и позвоночными животными.
Иммунитет и специфическая профилактика. Животные-реконвалесценты приобретают иммунитет, продолжительность которого не изучена. В США и странах Латинской Америки для профилактики ВЭЛ применяют аттенуированную живую вакцину ( из шт. ТС-83), которая защищает лошадей и ослов против вирулентного штамма в течение 14 месяцев. Однократная иммунизация поверхностными гликопротеинами вируса защищала 70 % мышей от летальной инфекции вирулентным штаммом, а двукратная иммунизация обеспечивала 100 % защиту от заражения. В крови вакцинированных животных появляются КС и анти-ГА, динамика титра и продолжительность циркуляции которых не изучены. Помимо того, зарубежными исследователями на основе вирулентного шт. Тринидад получены аттенуированные штаммы линии ТС-82, получившие широкое применение в ветеринарной практике, но не нашедшие применения в медицинской практике из-за высокой реактогенности.
Инактивированную вакцину готовят из шт. Guajira, культивируемого в клетках ВНК. Введение инактивированной вакцины ТС-84 после живой ТС-83 оказывало хороший бустерный эффект. На основе ростовой среды Игла разработана высокоэффективная стабилизирующая питательная среда MEM Hepes, содержащая в качестве добавки 2-(винил оксиэтилен) дитиокарбомат калия-виндиатат. Добавление в среду виндиатата в количестве 10-5—10-6 мол. % повышает термостойкость мембран клеток и вирусов, так как обладает антиагрегационным, антигемолитическим, иммунологическим и термопротективным действием, что обнаружено впервые и доказано экспериментально.
Повышение термоустойчивости вирусного материала имеет существенное значение для сохранения биологической активности вирусных препаратов при их создании и хранении. Биологическая активность вирусных суспензий, полученных с использованием виндиатата, превышает биологическую активность контрольных партий вируса ВЭЛ в условиях 37 °С. Представлена новая вакцина против вируса ВЭЛ. Использован шт. Тринидад, инактивированный формальдегидом, с активностью 3,3—3,9 lg ГАЕ и содержанием белка 100+10 мкг/мл. Цель изобретения — повышение иммуногенной активности вакцины и создание защиты при аэрозольном способе заражения. Для размножения вируса ВЭЛ использовали культуру диплоидных клеток легкого эмбриона человека Л-68, клетки заражали вирусом в дозе 0,1—0,01 БОЕ/клетку. Вируссодержа-щий материал обрабатывали 3-кратно ультразвуком, концентрировали полиэтилен-гликолем, очищали в градиенте плотности сахарозы, инактивировали формальдегидом и проводили сорбцию на А1(ОН)з. Полученная вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью. За счет того, что инактивации подвергается уже очищенный препарат вируса, достигается безопасность и ареактивность вакцинного препарата.
Зарегистрировано изобретение, которое относится к молекулам кДНК, кодирующим инфекционные формы западного, восточного и венесуэльского (варианта IIIA) Вирусов энцефалита лошадей, а также к молекулам кДНК, кодирующим структурные белки венесуэльского вируса энцефалита лошадей варианта ША. Кроме того, изобретение относится к новым мутантным формам западного и венесуэльского (варианта IE) вирусов, которые содержат мутации, ослабляющие их инфекционность, и использованию этих форм в качестве компонентов вакцин. Наряду с этим в изобретении описаны ослабленные химерные альфавирусы и их применение.
Показано, что среди индукторов интерферона, относящихся к различным классам соединений, наиболее эффективными в отношении возбудителя венесуэльского энцефаломиелита лошадей являются производные акриданома-камедонциклоферон, анандин и неовир. При однократном применении этих препаратов за 4 ч до заражения достигается 90—100 % защитный эффект при заражающих дозах возбудителя от 10 до 100 LD50.
Первичная защита от вируса связана с вирусспецифическими антителами. Однако корреляция между уровнем сывороточных антител и защитой недостаточна, если вирус проникает с помощью аэрозольного метода. Показана связь между титром антител в сыворотке и слизистой носа. Интраназальное введение антител приводит к пассивной иммунизации, защищающей мышей Balb/c при интраназальном заражении. Вакцинация штамма мышей дМТ, не содержащих функциональные В-клетки, неспособных к выработке антител, показала нормальную пролиферацию клеток селезенки in vitro и высокую продукцию цитокина. Аэрозольное заражение мышей FiMT показало, что полная защита наступает, лишь если пассивная иммунизация антителами дополняется активной иммунизацией вакцинным штаммом ТС-83 вируса. Таким образом, показана необходимость опосредованных клетками иммунных функций для защиты от передающегося воздушным путем заражения ВВЭЛ (29).