Модификация определения общего кальция в сыворотке крови животных с комплексоном Арсеназо III.

Изложена модификация методики по определению содержания общего кальция в сыворотке крови человека для животных. Приведены результаты апробации методики со статистической обработкой данных.

Необходимость измерения концентрации кальция в сыворотке крови животных обусловлена его важной физиологической ролью в организме животных.

В ветеринарной практике для определения концентрации данного элемента в крови широко применяются объёмные методы анализа с использованием флуорексона, мурексида и других подобных комплексообразователей [3]. Несмотря на простоту этих методов, для них характерны существенные недостатки, усложняющие определение концентрации кальция, а именно: недостаточно резкий переход окраски индикатора в точке эквивалентности. Этот субъективный фактор способен вызвать появление систематической ошибки, величина которой зависит от остроты зрения исследователя, цветовосприятия и других причин. Причём, данная ошибка чаще бывает положительного знака, то есть конечный результат является завышенным по отношению к фактической концентрации кальция.

В современной гуманитарной медицине, в частности клинической биохимии, объемные и другие подобные методы анализа практически не применяются. В настоящее время наиболее перспективными методами определения кальция являются фотометрия пламени, атомно-адсорбционная фотометрия, колориметрия в растворе с применением цветных комплексообразователей [1].

Последний метод широко используется в практической работе как наиболее простой и приемлемый для проведения массовых анализов, доступный по реактивам и оборудованию, а, следовательно, и относительно дешёвый. Для колориметрического измерения концентрации кальция в растворе предложено много комплексообразующих реагентов: мурексид, глиоксаль-бис-оксианилид (ГБОА), о-крезолфталеинкомплексон (о-КФК), метилтимоловый синий, а также реагенты группы Арсеназо [2]. Из них практически в наборах реактивов различных фирм используется чаще всего Арсеназо III.

Арсеназо III относится к металлокомплексонам из группы диазокомплексообразователей, который образует хелаты с целым рядом ионов (Th, HO22-, Zn, Pu, Ba, Ca, Sr). Из всех этих ионов в сыворотке крови в значительном количестве присутствует только ион кальция, что и позволяет использовать данный реагент для определения его концентрации.

Мешающее влияние ионов натрия проявляется при превышении его концентрации более чем в 300 раз, ионов калия и магния примерно в 100 раз по отношению к кальцию.

Применение Арсеназо III, который обладает высоким коэффициентом молярной экстинции (16·103) даёт возможность существенно уменьшить объём исследуемого субстрата по сравнению с другими (объёмными) методами анализа [1].

В основе предлагаемой методики лежит описание определения общего кальция в крови человека [1], в которое были внесены изменения, обусловленные иным белковым составом крови животных.

Применение оригинального описания к определению кальция в сыворотке крови животных сопровождалось коагуляцией сывороточных белков и помутнением раствора, что делало проведение исследований невозможным.

Цель нашей работы заключалась в модификации методики по определению кальция в сыворотке крови человека приемлемой для животных, в смысле: создания условий в растворе, препятствующих коагуляции белков. Для этого было испытано два детергента: тритон X-100 и додецилсульфат натрия, которые часто используются в практике как солюбилизаторы белков.

По нашим данным, тритон X-100 не обладает антикоагулирующей способностью против сывороточных белков животных в данных условиях. Поэтому мы предлагаем в качестве детергента додецилсульфат натрия, оптимальная концентрация которого установлена экспериментальным путем и на наш взгляд, составляет 0,1%.

В связи с тем, что концентрация детергента в предлагаемой модификации превышает таковую по отношению к оригинальной в 2,5 раза, то, по всей вероятности, следовало бы увеличить концентрацию реагента.

В результате проведенных исследований было установлено, что оптимальная концентрация Арсеназо III составляет 0,3 ммоль/л (т. е. в два раза больше, чем в оригинале ).

Данные изменения позволили повысить уровень экстинции в исследуемых пробах до 0,12-0,15 при уровне кальция в них 8-12 мг%.

Принцип метода. При смешивании раствора Ареназо III и сыворотки крови происходит образование хелата кальция с Арсеназо III, который характеризуется максимумом поглощения излучения в красной зоне спектра (650-670 нм). Интенсивность поглощения прямо пропорциональна концентрации кальция в диапазоне 0,5-3,5 ммоль/л.

Реактивы: 1. Арсеназо III ч. д.а. 2. Додецилсульфат натрия. 3. Ледяная уксусная кислота х. ч. 4. Ацетат натрия ч. д.а. 5. Кальций углекислый безводный ч. д.а. 6. Соляная кислота ч. д.а.

Рабочие растворы реактивов: 1. 0,1 моль/л ацетатный буфер с pH 4,75. 2. Рабочий реактив Арсеназо III:0,3ммоль/л Арсеназо III в 0,1 моль/л ацетатного буфера pH 4,75, додецилсульфат натрия - 0,1%. Реактив стабилен, сохраняется не менее 6 месяцев при комнатной температуре и не менее года при хранении в условиях холодильника. 3. Калибровочные растворы кальция с концентрацией 1-3,5 ммоль/л.

Ход определения. К 5мл рабочего реактива Арсеназо III добавляют 0,05мл сыворотки крови (соотношение 100:1), смешивают, избегая образования пены. Через две минуты измеряют оптическую плотность образцов сыворотки крови против рабочего реактива Арсеназо III в кювете с толщиной слоя жидкости 10мм при длине волны 670нм (красный светофильтр). Параллельно измеряют калибровочные пробы аналогично опытной, но вместо сыворотки добавляют калибровочные растворы кальция с концентрацией от 1 до 3,5 ммоль/л.

Концентрацию кальция определяют по калибровочному графику.

Примечание. 1. Исследуемая сыворотка не должна содержать следов гемолиза, алиментарной гиперлипидемии.

2.Исследование сыворотки проводят в течение двух суток после получения и хранении при температуре не более 4ºС.

3.Посуда для определения кальция должна быть химически чистой. Желательно не использовать стеклянную посуду, а применять полимерную (из полипропилена или полистирола).

4.Объемы рабочих растворов реактивов можно пропорционально уменьшить при микроопределении.

Нами было проведено параллельное определение кальция в крови животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади) двумя методами: титрованием с мурексидом и колориметрическим методом с Арсеназо III.

Результаты исследований представлены в таблице.

Таблица - Средние величины концентрации кальция (мг%), определённые двумя методами (n=83)

Как следует из данных таблицы, существенных различий при определении кальция выше указанными методами не установлено. Кроме того, установлена высокая положительная корреляционная связь между определяемыми показателями, что свидетельствует о сходимости результатов, полученных двумя методами.

Таким образом, предлагаемая модификация определения концентрации кальция отличается простотой и производительностью. Готовый рабочий реактив достаточно стабильный, что позволяет использовать его в течение шести месяцев и больше, при соблюдении надлежащих условий хранения. Предполагается в дальнейшей работе провести испытание предлагаемой методики для исследования содержания кальция в крови птицы, кошек, собак и других животных.

Список используемой литературы.

1.  Овсянников А. И., Коньков С. А., Гуркало В. К. Измерение содержания кальция в сыворотке крови и других биологических жидкостях комплексоном Арсеназо III.//Клиническая лабораторная диагностика.-1999.- №1.-с.16-18.

2.  Комплексные соединения в аналитической химии. Теория и практика применения./ Ф. Умланд, А. Янсен, Д. Тириг, Г. Вюнш. Пер. с нем. яз. О.М. Петрунина. - М.: мир, 1975.

3.  Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии: Справочное издание/ И. П.Кондрахин, Н. В.Курилов, А. Г.Малахов и др. – М.:Агропромиздат, 1985.

Модификация определения общего кальция в сыворотке крови животных с комплексоном Арсеназо III.

Лизогуб М. Л., к. б.н., доцент, Куевда М. М., аспирант

Научный руководитель - Кондрахин И. П., д. в.н., профессор

Крымский ГАТУ, г. Симферополь

Представлена модификация методики по определению содержания общего кальция в сыворотке крови человека для животных. Представлены результаты апробации методики со статистической обработкой данных.

The variation of measurement of total calcium in the serum animals by Arsenaso III complexone.

Lizogoob M. L.,c. b.s., candidate, Kuevda N. N., candidate,

Science ruler: Kondrachin I. P., d. v.s.,professory.

Crimean SATU, Simferopol

The variation of measurement of total calcium in the serum of blood human by the animals are described. Was saw materials approbation measurement with statistic’s analyses facts.