Японский энцефалит
[Japanes В Encephalitis (англ.); Japanische B-Enzephalitis (нем.)]
Японский энцефалит (ЯЭ)(японский энцефалит В, русский осенний энцефалит) - тяжело протекающая инфекционная болезнь людей, лошадей и других животных, проявляющаяся общими токсикоинфекционными явлениями и развитием ме-нингиальных и общемозговых симптомов.
Впервые выделил вирус японский исследователь Хаяши в 1934 г. В СССР его выделил и изучил Шубладзе (1940 г.), Смородинцев и Неустроев (1941 г.).
ЯЭ распространён в Японии, на всей территории Юго-Восточной Азии и Юго-Восточной Индии. Вирус сохраняется в организме птиц, комаров и других животных. В 1978 г. в Индии (в штате Уттер-Прадеш) заболело 3451 человек, из них умерло 1093. ЯЭ эндемичен в Таиланде и Индии. В 25 % случаев ЯЭ приводит к летальному исходу. У 30 % выздоравливающих имеет место нейропсихиатрические нарушения.
Клиническая картина и патологоанатомические изменения. При экспериментальном заражении инкубационный период у лошадей продолжается от 4 до15 дней. Болезнь протекает остро и характеризуется токсическими и нервными явлениями. Наблюдаются фибриллярные подрагивания мышц, иногда гиперкинезы, параличи. Возможны приступы сильного возбуждения. Больные впадают в коматозное состояние, наступает общий паралич и смерть. Болезнь длится 8-10 дней. Выраженные изменения отмечают в головном мозге. Селезёнка увеличена, с кровоизлияниями под капсулой. На слизистой мочевого пузыря мелкие кровоизлияния. У свиней вирус может вызывать аборты или рождение мёртвых плодов. У супоросных свиноматок вирус ЯЭ вызывает аборты и другие репродуктивные нарушения; у хряков могут наблюдаться острые орхиты. У лошадей развиваются поражения ЦНС, подобные поражения также регистрируют у обезьян и ослов.
У инфицированных животных развивается виремия от 12 ч до нескольких дней, после чего вирус диссиминирует в печень, селезенку и мышцы. Дальнейшая репликация вируса в этих органах поддерживает виремию. Затем вирус проникает в ЦНС с цереброспинальной жидкостью, эпителиальными клетками, макрофагами или лимфоцитами. У людей и мышей ВЯЭ селективно поражает нейроны, главным образом таламуса, базальных ганглий и нижнего слоя коры. При интра-перитонеальном заражении мышей ВЯЭ размножается сначала в перитонеальных макрофагах и только на 3-й день - в макрофагах селезенки. Патогистологические изменения наиболее выражены в ретикулоэндотелиальной системе в виде фокусов гиперплазии герминативных центров в селезенке, и интерстинальной пневмонии.
Морфология и химический состав. Средний диаметр вириона с оболочкой 40 нм. Форма гексагональная. Вирус содержит одноцепочечную РНК. Полная нуклеотид-ная последовательность геномной РНК составляет 10 976 нуклеотидов, соответствующих 3432 аминокислотным остаткам. Плотность в градиенте сахарозы 1,18 г/см3. В вирионах выявлены три структурных и несколько неструктурных белков. Структурные белки включают оболочечный гликопротеин Е (54 кД), негликозили-рованный оболочечный протеин М (8 кД) и капсидный протеин С (14 кД). Оболочечный протеин Е носитель эпитопов, ответственных за индукцию ВНА. По крайней мере 9 эпитопов установлено в протеине Е и один N-сайт вирусспецифический (20).
По данным других исследователей, в состав вируса входят три полипептида: ГП {мол. м. 25000 Д), НП (мол. м. 16000 Д) и МП (мол. м. 9800 Д). Выяснен аминокислотный состав белков V3 двух шт. ВЯЭ: Nakayama-NJH и JaGAr-01. Определена полная последовательность нуклеотидов его геномной РНК. Общая длина РНК составляет 10 976 нуклеотидов. На N-конце полипротеина локализуется белок С, далее белок М и Е. С-концевую часть полипротеина занимает неструктурный белок - РНК-зависимая РНК-полимераза.
Трехмерная структура гликопротеина оболочки ВЯЛ предсказана с использованием данных рентгеноструктурного анализа гликопротеина оболочки ВЯЛ и стратегии моделирования, основанной на гомологии. Вирус имеет вытянутую форму и содержит несколько слоев, две сс-спирали и три домена. Структура сольватированного водой вируса использована для предсказания конфюрмационных и линейных эпитопов. Полученные данные указывают на важность третичных структур для определения антигенных свойств флавивирусов в целом и вируса японского энцефалита в частности.
Методом олигонуклеотидного фингерпринта установлено, что имеют место мутации штаммов вируса, выделенных в разных зонах Японии и Таиланда. Подобно другим альфавирусам в геноме ВЯЭ одна открытая рамка считывания. Актиномицин Д и митомицин практически не влияют на репликацию вируса.
Вирус разрушается за 30 мин при 56 "С. Имеется стабильный вариант, выделенный клонированием в культуре ткани, у которого при 60 град.С сохраняется 65 % исходной инфекционности. При 25 град.С менее устойчив, чем вирус ЗАЭЛ, не устойчив при рН 10,0 и 7,0; рН 8,5 является оптимально стабилизирующим. При рН 3,0 инфекционный титр снижается. Разрушается эфиром и дезоксихолатом; в лиофилизированном виде сохраняется не менее 10 лет, при -70 град.С - не менее года без снижения титра, при -20 град. - не менее года со значительным снижением титра. При -76 град.С вирулентность вируса сохраняется до 8 лет.
Вирионы содержат 2 КС АГ мол. м. 58-Ю3 Д и 24-103 Д - гликозилированный полипептид V-3. Имеются как связанные с вирусной частицей, так и растворимые ГА и КС АГ.
Антигенная активность. У естественно заражённых лошадей и людей обнаруживают ВНА и анти-ГА, которые выявляются через неделю и сохраняются в течение нескольких лет. КСА появляются значительно позже и исчезают раньше. В Китае обнаружен высокий процент серопозитивных в РН сывороток среди животных: свиней - 100 %, лошадей - 94, КРС - 92 и собак - 66 %. АГ-структура данного вируса изучена с помощью монАТ.
Установлено, что in vitro происходит усиление инфекции флавивируса в присутствии субнейтрализующих концентраций гомо - или гетерологичной антисыворотки. Однако значение этого феномена in vivo до сих пор неизвестно. Для его объяснения было исследовано влияние пассивной иммунизации мьшей антнсывороткой к вирусу японского энцефалита (JEV) на исход инфекции. В результате, было показано, что введение мышам субнейтрализующих концентраций гетерологичной JEV антисыворотки приводит к увеличению у мышей титров виремии и к гибели животных после заражения вирусом долины Мюрей дикого типа. Полученные данные подтвердили предположение о том, что субнейтрализующне концентрации антител могут усиливать инфекцию флавивируса его вирулентность in vivo. Эти результаты важны для разработки программ вакцинации против JEV в географических ареалах, где этот вирус коциркулирует с вирусом энцефалита долины Мюрей.
Антигенная вариабельность и родство. Между штаммами ВЯЭ существуют АГ-различия. Выявлено два иммунологических типа вируса. Более однородную и близкую группу образуют шт. Накаяма, СП-69 и Пекин-1. Другой тип представлен шт. Джа-гар-01. Установлено родство всех штаммов ЯЭ с вирусом лихорадки Западного Нила, в особенности у шт. Джагар-01 со шт. Нр-94. В АГ-отношении ВЯЭ близок к вирусам Муррея, энцефалита Сан-Луи и Илеус. Степень АГ общности разная. Более родственны вирусы ЭЯ, энцефалита долины Муррея, вирус Илеус стоит несколько обособленно. Все пять изолятов ВЯЭ по всей длине генома имели высокую гомологию нук-леотидных последовательностей (более 93 %). Примерно такой же степенью гомологии характеризовались и белки пяти исследованных изолятов ВЯЭ. С использованием монАТ в РТГА, РН и ELISA также продемонстрирована тесная связь ВЯЭ с вирусом энцефалита Муррей Валли, вирусом Западного Нила и менее тесную связь с вирусом энцефалита Сан-Луи. Эта связь также подтверждается сравнением гомологии нукле-отидов и аминокислот вирусов.
Вирус агглютинирует эритроциты цыплят, гусей, голубей, петухов, барана, морской свинки, кролика. ГА получают из мозга мышей и из жидкости инфицированных культур. На протяжении 90 пассажей вируса в культуре почек эмбриона овцы ГА регулярно обнаруживался в титре 1:128 - 1:512. В культурах ФЭК ГА находят лишь в одном пассаже после заражения мозговой взвесью вируса. Оптимум рН для хранения АГ из ткани мозга 6,3-6,5, для культуральных 6,0-6,2. Старые лабораторные штаммы могут утрачивать ГА-активность.
У многих животных развивается вирусемия, что имеет большое значение в рассеивании вируса. У мексиканских летучих мышей вирус размножается в буром жире, депонируется там, и поэтому поддерживается 15-30-дней вирусемия. Вирус проходит через плаценту и обнаруживается в органах плода животных.
Эксперементальная инфекция. Вирус патогенен для мышей. Инкубационный период болезни при заражении в мозг 4-5 дней, при периферическом введении 30-60 суток многие животные выживают. Титры вируса в мозге заражённых мышей в пределах 106 и 10s. Восприимчивы белые крысы не старше 14 дней, молодые хомяки, морские свинки, обезьяны, ягнята и овцы. Экспериментальную инфекцию удаётся легко вызвать у мышей, щенков, коз, свиней, летучих мышей и птиц различных видов.
Культивирование. Благоприятной средой для размножения вируса является КЭ. Вирус культивируется также в различных тканях и клетках in vitro. ЦПД его проявляется лишь в немногих культурах и определяется свойствами штамма и клеточной линии. Оно постоянно наблюдается в первичных культурах почек эмбрионов свиньи, овцы и почек хомяка. Максимальное накопление вируса происходит на 2-3-й сутки, к этому же сроку развиваются и ЦП И. В культуре фибробластов КЭ под агаром вирус образует бляшки, которые по размеру разделены на три группы: мелкие (до 3 мм), крупные (более 5 мм) и бляшки непостоянного размера. Крупнобляшечные варианты вируса оказались высокопатогенными. Вирус репродуцируется в перевиваемых линиях клеток - Vero, BMK-21 (baby monkey kidney - клетки почки обезьян-малышей), L-M. Часто используются культуры клеток москитов из эмбриональной или личиночной ткани (перевиваемая линия клеток личинок москитов С6/36). Недавние исследования показали, что лейкоцитарные культуры различного происхождения - прекрасная среда для репродукции ВЯЭ. Инсулин, адренокортикотропный гормон, конканавалин А, гидрокортизон стимулируют репродукцию ВЯЭ в культурах клеток.
Созревание вирионов происходит в цистернах эндоплазматического ретикулума, а транспорт вируса происходит внутриклеточной секреторной системой. Выход вируса осуществляется за счет лизиса клеток или "обратного" фагоцитоза.
Пассажи вируса ЯЭ на клетках HeLa приводят к аттенуации вирулентности для мышей. После шести пассажей на клетках четырех штаммов ВЯЭ дикого типа: Nakayama original, 826309, SA14 и Beijing-1, шт. Nakayama original и 826309 стали атте-нуированными для мышей, причем аттенуация сохранялась при пассажах на первичных клетках КЭ и клетках LLC-MK2 и С6/36. Аттенуация сопровождалась изменением связывания с препаратами мембранного рецептора из мозга мышей, что указывает на участие в аттенуации белка оболочки El. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов структурных белков вирулентных шт. Nakayama original и 826309 и их аттенуированных вариантов обнаружило соответственно 37 и 46 замен нуклеоти-дов, вызывающих замены соответственно 8 и 9 аминокислотных остатков. Белок оболочки Е и мембранный белок двух аттенуированных ВЯЭ идентичны, за исключением одной аминокислотной замены в белке оболочки Е.
Источники и пути передачи инфекции. Вирус, вероятно, является паразитом диких птиц, особенно ночных цапель. В Японии основным переносчиком его является комар Culex tritaeniorhynchus; в других странах переносчиками могут быть другие представители семейства Culicine, в Индии, например, C. vishnui. Зимой резервуаром вируса могут служить находящиеся в зимней спячке комары и летучие мыши. Обычно инфицируются домашние свиньи, у них наблюдается вирусемия. В Южном Таиланде инфицированы до 70 % свиней; при этом основным вектором передачи вируса являются москиты, однако степень распространения ЯЭ среди людей низка. В умеренных зонах ВЯЭ переживает зиму, но инфицирования зимой практически не наблюдается. У цыплят и перелетных птиц возможно круглогодичное носительство AT. Резервирование ВЯЭ возможно и у холоднокровных животных.
В естественных условиях заболевают лошади, свиньи и человек. Дикие утки основные носители вируса, который переносится на домашних животных в течение и после сезона дождей; 90 % ворон, голубей и королевских рыболовов содержали AT к одному из трех вирусов (ВЯЭ, вирусу лихорадки Западного Нила или вирусу Денге). К вирусу чувствительны также КРС, овцы, козы, собаки, утки, цыплята, перелетные птицы и рептилии. Экспериментально заражаются полевые мыши и некоторые виды ящериц.
Иммунитет И Специфическая профилактика. Поскольку свиньи являются естественными носителями ВЯЭ, их иммунизируют инактивированной вакциной с адъю-вантом Фрейнда для предупреждения развития виремии. Другой метод вакцинации заключается в применении авирулентного вируса Западного Нила с последующей прививкой инактивированным ВЯЭ. В медицинской практике применяют вакцину из аттенуированного шт. т-рк/Л. Для специфической профилактики ЯЭ лошадям вводят живую вакцину из шт. G53, G53g, G53 и 79. Наиболее эффективным оказался шт. 79. К 14-му дню титр КСА у вакцинированных лошадей достигает максимума и затем в течение 4 недель снижается. ВНА появляются через месяц после иммунизации.
Для предупреждений мёртворождений у свиней предложена живая вакцина (из аттенуированного шт. S). У этого штамма снижается активность репродукции в организме комаров Culex titaeniorhynchus summorosis. В Японии в результате ежегодно проводимой вакцинации инактивированной вакциной заболеваемость животных ЯЭ не регистрируют с 1967 г.
Другой вакцинный штамм ВЯЭ (кроме шт. Nakayama original) отличался от вирулентного 15-ю нуклеотидными заменами. В белках наружной оболочки обнаружено пять отличий в аминокислотной последовательности. В Е. соИ была встроена кДНК ВЯЭ, кодирующая облолочечные гликопротеины Е и неструктурный белок NS-1. Экспрессированный белок в смеси с адъювантом создавал у мышей устойчивость к заражению вирулентным вирусом. В опытах с ВЭЛ было установлено, что популяция вируса, размноженного в клетках ВНК-содержит две группы клонов: медленно проникающие в клетки и вирулентные, быстро проникающие в клетки, и авирулент-ные. Используя данный принцип был получен аттенуированный шт. А-14-2 для живой вакцины против ЯЭ.
Предпринимаются попытки создания генноинженерной вакцины. Сообщалось, что монАТ к эпитопам гликопротеина Е оболочки ВЯЭ защищают мышей от экспериментального заражения.
