Инфекционный бронхит птиц
[Avian Infectious Bronchitis, Infectious Bronchitis of baby Chicken (англ.); Infectiose Bronchitis des Huhnes, Austeokende tracheobronchitis der Kuken (нем.); Bronchite Infectiouse (франц.)]
Инфекционный бронхит (ИБ) - болезнь, поражающая кур. У цыплят проявляется респираторным и уремическим синдромами, у кур - поражением герминативных органов, что ведет к длительному снижению яйценоскости. Болезнь встречается во всех странах, где птицеводство поставлено на промышленную основу.
Впервые вирус выделили Бич и Шалк в США в 1936 г. ВИБ - первый, описанный в литературе коронавирус птиц и первый коронавирус, в геноме которого полностью определена последовательность нуклеотидов. Сравнение нуклеотидной последовательности генов нуклеокапсида трех штаммов ВИБ (Grey, Arcansas 99 и Holland 52) свидетельствует об их высокой консервативности (гомология 91,1-96,5).
Симптомы и патологоанатомические изменения. Отмечают три клинических синдрома: респираторный, нефрозно-нефритный и репродуктивный.
Респираторный синдром проявляется у молодняка и характеризуется кашлем, трахеальными хрипами, носовыми истечениями, затрудненным дыханием (с открытым клювом), иногда конъюнктивитом, ринитом и синуситом. Высокая летальность наблюдается, главным образом, среди цыплят до месячного возраста, у 2-3-месячного молодняка она может достигать 90 %, но чаще бывает в пределах 10-35 %. У цыплят 30-60-дневного возраста болезнь протекает, как правило, хронически и в ассоциации с колибактериозом и микоплазмозом. При патологоанатомическом вскрытии обнаруживают серозный, катаральный или казеозный экссудат в трахее или бронхах.
Некоторые штаммы вируса обладают нефротропностью (нефрозно-нефритный синдром) и могут в течение первых двух недель поражать почки и мочеточники с отложением уратов. Течение болезни - острое. У больных птиц отмечают депрессию и диарею с примесью уратов. При первичной циркуляции вируса в хозяйстве летальность птицы достигает 50-70 %. При патологоанатомическом вскрытии обнаруживают набухание почек и пестроту рисунка. Микроскопические изменения варьируют от нефрита до некротического нефроза.
Выделенный в Китае местный штамм D IBV вызывал тяжелое опухание железистого желудка у цыплят. В электронном микроскопе были выявлены вирусные частицы, которые были покрыты оболочкой и имели характерные булавовидные выпячивания по поверхности. Диаметр вирионов был около 80-140 нм. Аллантоисная жидкость инфицированного куриного эмбриона после обработки 1 % Трипсином в течение одного часа обладала гемагглютинирующей активностью. Гибель эмбрионов и их карликовость увеличивались после серийных пассажей. К 5-му пассажу наблюдались характерные изменения эмбриона, который округлялся, амнион утолщался и тесно прилегал к нему, эмбрион переставал расти и погибал. Тот же вирус выделялся от 10-дневных SPF цыплят при тяжелом провентрикулите, индуцированным после введения суспензии пораженной ткани железистого желудка от погибших цыплят.
Поражение репродуктивных органов (репродуктивный синдром) регистрируется обычно у кур старше 6 месяцев. Заболевание протекает бессимптомно или с незначительным поражением органов дыхания. Единственным проявлением болезни в этих случаях является длительное снижение яйценоскости на 30-80 %, которое зависит от возраста птицы. В дальнейшем яйценоскость восстанавливается, но не достигает прежнего уровня. Больные куры несут мелкие, неправильной формы яйца с тонкой скорлупой. При патологоанатомическом исследовании кур, переболевших ИБ в раннем возрасте, часто наблюдают инфантильное состояние всего яйцевода, недоразвитость яйцевых фолликул.
В крупных птицехозяйствах ИБ имеет стационарный характер и протекает как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов; цыплят в более уязвимом возрасте (1-30 дней) в значительной степени защищает пассивный иммунитет. Поражение репродуктивного тракта у цыплят и кур неизбежно приводит к снижению яйценоскости. Только вирусологические исследования и анализ экономических показателей выращивания цыплят и продуктивности кур дают возможность диагностировать ИБ, протекающий хронически или в ассоциации с другими болезнями.
Острое течение ИБ характеризуется контагиозностью, массовой заболеваемостью, значительным снижением продуктивности, проявлением респираторных признаков болезни и появлением деформированных мелких яиц.
Морфология и химический состав. Анализ последовательностей гена S1 австралийских штаммов ВИБ Позволил идентифицировать две генотипически различных группы. Шт. VicS, V5/90, N1/62, N3/62, N9/74 и N2/75 относятся к группе I. Все штаммы группы 1 способны размножаться в трахее и почках, но только четыре из них (VicS, N1/62, N9/74, и N2/75) являются нефропатогенными с летальностью 32-96 %. К группе 2 отнесены шт. N1/88, 03/88 и V18/91, которые размножаются лишь в трахее и не ведут к гибели птицы. Идентичность аминокислотной последовательности при сравнении трех штаммов составляла 72,3 - 92,8 %, при сравнении с вирусами группы 1 - 53,8 - 61,7 %. Данные штаммы отличаются также от шт. Массачусетс 41 и Д1466 (идентичность 47,5 - 55,7 %). Штаммы N1/88, 03/88 и VI8/91 образуют новую группу вирусов, генотипически отличающуюся от всех, ранее охарактеризованных. Не установлено корреляции между аминокислотной последовательностью S1 и нефропатогенностью. Морфологически ВИБ типичный коронавирус.
В трупах павшей птицы вирус быстро теряет инфекционную активность; в питьевой воде при комнатной температуре он сохраняется 11 ч; в пораженных тканях, в 50 %-ном растворе глицерина при температуре 4 град.С - до 80 дней; в аллантоисной жидкости при температуре 37 град.С - 3 дня, при 20-30 град.С - 24 дня, при 4 град.С - 427 дней, при -25 град.С - 537 дней. В инфицированной аллантоисной жидкости при температуре -30 град.С вирус активен 17 лет.
Большинство штаммов ВИБ кур инактивируется за 10 мин при 56 град.С, однако среди них встречаются варианты, различающиеся по терморезистентности. Все штаммы ВИБ относительно резистентны к кислой среде (рНЗ,0) и чувствительны к щелочной среде (рНП), чувствительны к хлороформу и дезоксихолату натрия. Некоторые из них (Ве-42 и Connauqht) после обработки эфиром обладают остаточной инфекцион-ностью. По чувствительности к эфиру и прогреванию при 45 град.С в течение 90 мин все штаммы ВИБ разделены на три группы: первая группа включает Ве-42 и Connauqht - штаммы, чувствительные к двум обработкам; вторая группа включает шесть штаммов, которые относительно резистентны к эфиру, но чувствительны к прогреванию при 45 град.С в течение 90 мин; в третью группу входят шт. В-41 и КН, которые резистентны к эфиру и прогреванию. При лиофилизации все штаммы резистентны к трипсину, очень чуствительны к ультрафиолетовому облучению. Глюкоза (10 %-ный раствор) стабилизирует вирус. Под действием УФ-лучей ВИБ разрушается через 18-24 ч. Солнечные лучи инактивируют его при 36-38 град.С за 3 ч; 1 %-ные растворы фенола, крезола, формалина, 70 %-ный этиловый спирт и р-р соды (1:10000) обезвреживают в течение 3 мин.
Антигенная структура. ВИБ имеет два гликопротеина: поверхностный S и мембранный М. Белок SP этого вируса состоит из двух гликопротеидов SP1 и SP2, образующихся в результате посттрансляционной модификации. Пепломерный белок путем протеолиза был разделен на две части: N-терминал S1 и С-терминал S2 гликопепти-да. Белки ВИБ различаются по тканевому тропизму. Изменение патогенности штаммов вируса связано с изменением изоэлектрических точек их белков, поэтому классификация белков на основе изоэлектрических точек позволяет идентифицировать высокопатогенные и персистентные штаммы. У четырех английских штаммов, принадлежащих к трем разным серотипам ИБ, Sl-белки различаются по аминокислотному составу только на 2-3 %. Их аминокислотные последовательности были также очень близки аминокислотным последовательностям Sl-белков трех голландских изолятов (D207, D274 и D3896). С использованием 16 монАТ были обнаружены общие эпитопы ВНА у всех 8 изолятов, хотя поликлональные сыворотки дифференцировали их только на три серотипа. Эпитопы ВНА локализованы на первой и третьей четвертях S1 - белка. Серологические, эпизоотологические исследования ИБ должны быть дополнены анализом данных по секвенированию нуклеиновой кислоты и по взаимодействию с монАТ. Белки S, М и N ВИБ имеют мол. м. 84-87, 90-91 и 27-30 кД соответственно. Различают несколько европейских (z4) и американских (z4) серотипов, АГ связанных между собой. Сероспецифические эпитопы вируса локализованы, в основном, в первых 300 аминокислотных остатках пепломерного белка S. На поверхности ВИБ обнаружено пять АГ эпитопов: А, В, С, D и Е, из которых первые четыре ответственны за нейтрализацию вируса. Из 16 монАТ все реагировали с белками пепломеров, а один тип AT нейтрализовал инфекционность и подавлял ГА-активность вируса.
Антигенная активность, антигенная вариабельность и родство. Переболевание птицы сопровождается образованием анти-ГА, ВНА и практически пожизненным иммунитетом к гомологичному типу вируса. АГ-свойства вируса ассоциированы с шипами вирусной мембраны, состоящими из ди - и тримерного белка пепломера Е-2. Эти свойства связаны с субъединицей S1. Кроме основного белка S, у ВИБ в меньшей степени участвует в индукции ВНА также и белок М, он ответствен за синтез ингибиру-ющих ГА AT. Гуморальные ВНА появляются через 2 недели после заражения, между 6 - 8-й неделей титр их достигал максимума и далее до 20-й недели оставался постоянным, после чего снижался. У кур-реконвалесцентов ВНА обнаруживались через 482 дня.
ПА появлялись в сыворотке крови через 2-3 недели, но исчезали раньше, чем ВНА. При повторном заражении уровень ПА повышался. У экспериментально инфицированных 8-недельных цыплят они были выявлены на 10-й день и сохранялись в течение 10-14 дней, после чего процент цыплят, положительно реагирующих в РДП, постепенно снижался. Через месяц после заражения только 39,5 % цыплят имели ПА, а через 2 месяца они не были выявлены ни в одной исследованной сыворотке. В крови кур-реконвалесцентов найдены КСА.
Показана АГ - и иммуногенная вариабельность полевых штаммов ВИБ. Четко определены семь серотипов: A(D207), B(D3896), C(D3128), D(D212), Массачусетс (Mass), ИК11 и ИК12. В пределах указанных серотипов известны следующие штаммы: Массачусетсе, Коннектикут А5968, Айова-97, Айова-609, Грей, Холт, УМК Армиленд, Брисбеин, КН, Нерима, Ишида, Шида.
Выделен АГ вариант вируса, который отнесен к типу Индиана, и новый нефропа-тогенный АГ отличный вирус Р-84084. Антисыворотка к шт. Коннектикут А5968 нейтрализует все вышеуказанные гетерологичные штаммы, за исключением шт. Ишида. С помощью фингерпринтного анализа (теста "отпечатки пальцев") нуклеотидов РНК датских штаммов выделены две группы вирусов. В 1-ю группу из них вошли шт. Н52, Н120, D387, 1259, 1385, 1397, у которых установлено 99 % гомологии; во 2-ю - шт. D207, D274, D212, D1466, D3128, D3896, имевшие 95 % гомологии. Большинство выделенных в Нидерландах полевых изолятов ВИБ отличались по АГ составу от серотипов Массачусетс и датских серотипов D274, D1466, D3128. Поэтому возникла необходимость создания новой вакцины. Выделенные в нашей стране штаммы вируса в большинстве случаев имели родство с серотипом Массачусетс и значительно реже встречались штаммы, относящиеся к серотипу Коннектикут.
Проведено исследование генетических различий у изолятов вируса инфекционного бронхита (ВИБ), выделенных от цыплят - бройлеров в штате Миссисипи - амплификация и секвенирование сегмента в 582 пары оснований терминальной части гена S1 нуклеотидного белка 26 изолята типа Арканзас. Р-ПЦР И цикл секвенирования использовали для выявления генетической расшифрованной аминокислотной взаимосвязи между изолятами. Проведенный анализ показал, что нуклеотидные и аминокислотные последовательности изолята из Миссисипи были высоко консервативны и уровень их нуклеотидной гомологии оказался выше и составил 99,4 %, а аминокислотной - 98,4 %. Изоляты из Миссисипи имели менее 2,3 % нуклеотидных и 5,2 % аминокислотных различий с вакцинным штаммом Ark DPJ и менее 30 % нуклеотидных и 5,2 аминокислотных различий с изолятом варианта Джорджия Ark. Предполагается, что 26 изолятов ВИБ, генетически близкородственных вакцинному штамму, произошли в результате появления точечных мутаций в геноме этого штамма. Результаты также показали, что тип Ark ВИБ, циркулирующий в течение года в штате Миссисипи, генетически мало изменился или не изменился совсем. Выявление 21-го идентичного изолята ВИБ на различных птицефермах и комплексах явилось следствием особого контроля за распространением инфекционного бронхита среди бройлеров. Все 25 выделенных изолятов вируса ИБП (ВИБП) оказались близкородственными, но отнесены к изученным группам (на основании перекрестной реакции нейтрализации и полного анализа нуклеотидной последовательности S-1-гена. Они были отнесены к серотипу ДЕО 72. Сформирована отдельная группа вирусов ИБП, названная ее новым серотипом Джорджия-98.
Предполагается, что возбудителем SARS (тяжелый острый респираторный синдром - атипичная пневмония) является новый вид коронавирусов. Анализ гомологии последовательностей главных структурных белков вируса, включая S, М и N из 17 штаммов SARS-вируса, опубликованных Генбанком, и 11 штаммов других коронавирусов показал, что корреляция почти отсутствует между каждым штаммом SARS и другими штаммами коронавирусов, в особенности, изолированными в Китае. Результаты могут иметь большое значение для научных исследований по эпидемиологии и источнику патогена SARS и клинической практики КНР.
Генетическая группировка изолятов ВИБ, основанная на гипервариабельной области HVR1 (области 168-197), совпадает с группировкой, основанной на целом гене S1. Тайваньские изоляты ВИБ не удалось поместить в существующие группы. Тест нейтрализации использован для сравнения 9 тайваньских изолятов ВИБ из разных генотипов со стандартными штаммами Massachusetts (HI20) и Connecticut. Показано, что: 3 тайваньских изолята отличаются по серотипу от стандартных штаммов; они относятся к двум серотипам, коррелирующим с их генотипами. Тайваньские изоляты разбиты на группы с высокой, промежуточной и низкой патогенностью. Не установлено корреляции между патотипом и генотипом. С помощью специфических праймеров клонировали ген нуклеокапсида (N) нефропатогенного штамма X ВИБ. Сравнение последовательности N-гена штамма X с таковой 10 других штаммов ВИБ выявило наличие в N-гене штамма X 136 рассеянных сайтнаправленных мутаций. Гомология между штаммом X и некоторыми другими штаммами ВИБ варьировала от 86,26 до 99,67 %. Наибольшая гомология была выявлена между Х - и N-штаммами, принадлежащими к нефропатогенному типа ВИБ. Полученные результаты указывают на относительную консервативность N-гена ВИБ.
К ВИБ в естественных условиях восприимчивы куры всех возрастных групп, наиболее восприимчивы до 30-дневного возраста. Человек восприимчив к ИБ и перебо-левает с легкими признаками поражения верхних дыхательных путей.
Развитие инфекционного процесса сопровождается виремией с локализацией вирусного АГ в лейкоцитах и эритроцитах в течение 16-дневного после заражения. Вирулентные штаммы вируса инфицируют и разрушают реснитчатые эпителиальные клетки, выстилающие трахею. Вирус локализуется в субэпителиальных клетках и обнаруживается в них в течение 21 дня, и в селезенке - до 49 дней. Авирулентный вирус локализуется там же, но инфицирует только часть эпителиальных клеток. У птиц, зараженных контактно, вирус обнаруживают в глотке и трахее через 7, 14, 21 и 27 дней, а в почках - через 35 дней. У цыплят, зараженных интратрахеально, вирус в трахеаль-ной слизи выявляли в течение 5 недель после заражения. Показана возможность ви-русоносительства переболевшей птицы. Наличие инфекции в одном и том же хозяйстве в течение ряда лет свидетельствует о том, что выздоровевшие птицы остаются носителями вируса. Инокулировали 17-дневные куриные эмбрионы 8 различными штаммами вируса ИБ, которые представляют различные серотипы. На 2- и 5-й дни после заражения собирали ткани для гибридизации in situ с антисмысловым рибозон-дом к МРНК, Кодирующей белок мембраны. Во всех случаях на 2-й день выявили интенсивное окрашивание в цитоплазме, в эпителиальных клетках трахеи, легких, бурсы и кишечника. На 5-й день окрашивание было слабым или отсутствовало. Однако в клетках почек выявлялось многоочаговое окрашивание со штаммами Вольге-мут, Грэй, JMK и Масс41. Селезенка не содержала вирусную РНК.
Персистенция ВИБ, ее сроки зависят от штамма. Так, шт. Kagoshima-34 размножался и персистировал, в основном, в почках, а шт. Tottori-2 дольше персистировал в легких.
Экспериментальная инфекция. Ее можно вызвать при интратрахеальном, интрана-зальном, подкожном, внутримышечном, интраперитонеальном и клоачном заражениях цыплят. Однако интратрахеальный метод заражения более надежный. Инкубационный период продолжается 18-36 ч, но может затянуться до 6 дней и более, если инфицируют цыплят, содержащих материнские AT. Длительность инкубационного периода зависит также от дозы и пути введения вируса. При аэрозольном методе заражения симптомы болезни у цыплят проявляются уже через 18-24 ч.
После инфицирования респираторного тракта ВИБ локализуется и размножается в эпителиальных клетках яйцевода и остается там в течение 6-24 дней после инфекции. Инфицированный яйцевод становится инфантильным или кистозным. Вирус персистирует в организме кур не менее 30-45 дней. Из клоаки его выделяют чаще, чем из трахеи.
Кроме цыплят, можно заразить обезьян макака-резус и пещерных летучих мышей. Индейки невосприимчивы, однако при интравенозном введении вируса возникает виремия в течение 48 ч. Мышата-сосуны восприимчивы к шт. Боддет при интрацере-бральном заражении. Штаммы, прошедшие небольшое число пассажей на КЭ, для мышей непатогенны. Получен вирулентный вирус ИБК (ВИБК). После 10 пассажей на однодневных SPF-цыплятах штамма Д971 получен вирулентный штамм D97L)io. Вирулентность его на однодневных цыплятах составляла выше 106-45 ЭЛД5о/о,2 мл или 1015ЛД50/мл. У зараженных цыплят проявлялись типичные клинические признаки ИБК.
Культивирование. Удается в КЭ при заражении в аллантоисную полость, амнион или на ХАО. Адаптация ВИБ к КЭ происходит параллельно с возрастанием процента и сокращением срока гибели их. Заражают обычно 9-10-дневные КЭ. Адаптация вируса наступает через 3-6 и более пассажей. Зараженные КЭ погибают через 3-6 дней в 1-м пассаже до 10 %, в 5-м - до 61 ив 9-м - до 83 % И более. Однако гибель КЭ - не единственный признак заражения ВИБ. Характерно замедление их роста через 6-7 дней после заражения и увеличение количества экстраэмбриональной жидкости. Инфицированные КЭ шарообразной формы, мумифицированы, мельче, чем здоровые. Такой "эффект карликовости" - патогномоничный признак для ВИБ, имеет диагностическое значение при выделении полевых изолятов на КЭ. Кроме того, у инфицированных КЭ желток обычно сморщен, постоянно поражены почки и повышено содержание уратов. ХАО и амниотическая оболочки отечны, объем аллантоисной жидкости увеличен. При введении вируса в аллантоисную полость наивысшая концентрация его обнаруживается через 36 ч после заражения в ХАО, затем в аллантоисной жидкости, амнионе и печени эмбриона. Если погибшие эмбрионы остаются на некоторое время в инкубаторе, титр вируса снижается.
Максимальный выход вируса 107.2 ИД50/о,1мл выявляется при заражающей дозе 103 ЭИД50/0.1 мл в условиях 36 град.С. Более высокие заражающие дозы не увеличивают общего "урожая" вируса. Подбор оптимальной температуры и продолжительности культивирования является важным для повышения "урожая", если иметь в виду, что в аллантоисной жидкости погибших КЭ обнаружено интерферирующее вещество. Различные штаммы ВИБ могут при изменении температуры проявлять различную вирулентность для КЭ и органных культур, что отражает их вирулентность и тропизм.
Большинство штаммов вируса размножается в культуре клеток почки КЭ, фибробластов КЭ и ВНК-21. В клетках Mela никакие штаммы ВИБ не размножались. Органные культуры яйцеводов оказались высокочувствительными к инфицированию вакцинным шт. Н52. Однако, прежде чем вирус приобретает способность размножаться в первичной культуре клеток и органных культурах трахеи кур, его нужно адаптировать к КЭ. Вирус, адаптированный к мозгу мышей-сосунов, может обусловить прямую реакцию ГА и реплицироваться в клетках Vero. Титры вируса в этой культуре достигают 4,6-5,0104 БОЕ/мл. Культура клеток легкого и почек КЭ в 40-60 раз чувствительнее культуры клеток печени. Вирус также можно культивировать в органной культуре трахеи КЭ. ЦПД его в культуре клеток почки КЭ проявляется образованием синцития с последующим некрозом. Синцитий появляется через 6 ч, а через 18-24 ч он увеличивается, включая 100 и более ядер.
Все штаммы ВИБ в присутствии трипсина в среде покрытия 20-40 мкг/мл на 3-4-й день инкубации образуют бляшки до 6 мм в диаметре. Титр вируса в присутствии трипсина для разных штаммов достигает 3,ЗТ05 БОЕ/мл. Все изученные 17 австралийских штаммов ВИБ образовывали бляшки на 2-м пассаже в культуре клеток почки КЭ, которые различались по срокам их появления, размерам (от 2 до 5 мм) и внешнему виду. Хотя метод культивирования на КЭ в 18-84 раза более чувствителен метода бляшек, однако титрование методом бляшек оказалось более точным. Половые гормоны (эстраген, тестостерон, кортизон) повышают продукцию вируса в органных культурах трахеи. Из многих штаммов шт. Beaudette индуцирует бляшки в культуре клеток ВНК-21, на этих клетках из этого штамма, после обработки его мутагеном, был изолирован ts-мутант. Чувствительность перевиваемой линии клеток эмбрионов кур к ВИБ охарактеризована после 5 серийных пассажей. Репликация вируса определялась по цитопатическому эффекту с помощью ЭМ, НМФА и ОТ-ПЦР. Через 96 ч после инфекции ЦЭ составлял 75 %, клетки округлились, "сползали" в ЭМ, был виден коронавирус. Цитоплазматическая флуоресценция появлялась уже через 24 ч после инфекции, прогрессировала и все время соответствовала уровню вирусной РНК ВИБ инфицированных клеток, которая была выявлена в RT-PCR. Уровень внеклеточного вируса был измерен титрованием на клетках почки цыпленка и в куриных эмбрионах. В культуре клеток и КЭ относительные титры через 24-120 ч после инфекции колебались от 4,0 до 6,0 lg EIDso/cm3 на куриный эмбрион и от 2 до 6,0 lg TCIDso/cm3-Линия клеток CER оказалась пригодной для изучения вируса М41.
Особенности репродукции. Дефектная РНК (дРНК) CD-61 штамма Beaudette ВИБ Реплицируется и упаковывается при использовании 4 гетерологичных штаммов ВИБ (М41, Н20, HV10 и D207) в качестве вирусов-помощников. Секвенирование геномных РНК этих штаммов ВИБ показало, что уровень нуклеотидных различий составляет до 17 % в лидерной последовательности (ЛП) идо 4,3 % во всей смежной 5'-не-транслирующей области (5'-НТО). Анализ 5'-концов спасенных дРНК обнаружил, чтоЛП штамма Beaudette, присутствовавшая в CD-61, заменилась на ЛП штамма-помощника, но 5'-НТО соответствует исходной последовательности CD-61. Эти данные показали, что феномен переключения ЛП, описанный ранее для вируса гепатита мышей и бычьего коронавируса, наблюдается и во время репарации дРНК ВИБ. В 5'-НТО ВИБ имеются 3 предсказанные шпилечные структуры, первая из которых проявляет высокую степень ковариации среди штаммов ВИБ, что является филогенетическим доказательством существования этой структуры и ее возможного участия в репликации ВИБ. Первым событием процессинга полипротеина ВИБ является протеолиз пептидной связи глиб73-глиб74 под действием первого домена папаино-подобной протеазы PLPD-1 с освобождением зрелого белка 87 кД. Продукт, кодируемый областью нуклеотидов 2548-8865 ВИБ, расщепляется по дипептидной связи ГЛИ2265-ГЛ И2266 с образованием N-концевого белка 195 кД и С-концевого белка 41 кД. С использованием антисыворотки, полученной к последовательности ВИБ, кодируемой нуклеотидами 8865-9786, белок 33 кД, представляющий ЗС-подобную протеи-назу специфически иммунопреципитируется из зараженных клеток.
Большинство штаммов ВИБ не агглютинируют эритроциты птиц, однако при обработке вируса фосфолипазой С типа 1 он легко вызывает ГА. Энзим модифицирует оболочку вируса за счет разрушения фосфолипидов и вызывает появление на поверхности вириона ГА. Кроме того, ГА-свойства обоих типов ВИБ проявляются после обработки их 0,5 % раствором трипсина (90 мин при 37 град.С), который разрушает пептидные связи аргинина и лизина поверхностных молекул вирусного белка и освобождает скрытые молекулы ГА. У глубокоадаптированных к КЭ штаммов (подобных шт. Beaudette), имеющих высокий инфекционный титр после обработки трипсином, фосфолипазой С, нейраминидазой ГА активность не проявляется. Феномен объясняется изменением физической и химической структуры вирусного белка, связанной с потерей патогенности и иммуногенности вируса для птицы. В настоящее время уточнено, что шт. Коннектикут (Konnekticut) способен агглютинировать эритроциты кур, в то время как шт. Массачусетс (Massachusets) подобную активность проявляет только после обработки трипсином или фосфолипазой С. Отработан метод изготовления ГА антигена из изолятов ВИБ. Лиофилизированный ГА сохранял активность при -20 град.С в течение 8 недель, при 4 град.С в эти же сроки терял до 50 % ее. Титр ГА вируса повышается до 1:256 - 1:512 при его пассажах в трахее кур или клеточной культуре трахеи кур.
Гемадсорбирующие свойства не установлены.
Штаммы ВИБ различаются по интерферониндуцирующей способности. Так, из 10 штаммовтолько 3 (шт. IB-41, Нерима и Ишида) не индуцировали синтез интерферона в КЭ, тогда как остальные вызывали образование его до 190 ед.
Источники и пути передачи инфекции. Основным источником инфекции служат больные и переболевшие цыплята и куры, которые выделяют вирус во внешнюю среду или остаются вирусоносителями до 49-105 дней после переболевания. Выделение вируса из организма больной птицы происходит со слюной, истечениями из носа и глаз, с фекалиями. Птица заражается, в основном, аэрогенным путем, а также при приеме инфицированного корма и воды. Распространение инфекции возможно также через инфицированную внешнюю среду: помещения, кормушки, подстилку, одежду и обувь обслуживающего персонала. Кроме того, человек может быть и активным переносчиком вируса в период переболевания птицы ИБ. У петухов вирус выделяется со спермой в течение 20 дней после заражения, поэтому возможно заражение половым путем. Кроме того, вирус передается трансовариально при остром, хроническом и бессимптомном течениях болезни. Доказана возможность выделения его из яиц, полученных от кур через 1, 2, 4 и 6 недель после их заражения. Выделен вирус из яиц, полученных от кур в ранний период снижения яйценоскости, а у 30 % цыплят, выведенных из таких яиц, отмечали отечность. От этих цыплят удавалось выделить возбудителя ИБ. Вирус изолирован из желтка и белка яиц с глубоким поражением скорлупы, которые были получены от кур из хозяйства, неблагополучного по данной болезни. Таким образом, поколеблено прежнее представление об ИБ, как о заболевании только с горизонтальным путем передачи инфекции. Штамм птичьего вируса инфекционного бронхита был изолирован от курицы из группы птиц с симптомом снижения яйценоскости. Изолированный вирус в куриных эмбрионах интерферировал с ВНБ, приводил к снижению роста куриного эмбриона и вызывал агглютинацию эритроцитов цыпленка после обработки трипсином.
Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшая птица резистентна к заражению гомологичным штаммом вируса в течение 5-6 месяцев. Трудность в проблеме специфической профилактики обусловлена большой естественной АГ и иммунологической вариабельностью полевых штаммов вируса. К вирусу ИБ высокорезистентны цыплята линии С и высокочувствительны линии 151. Для профилактики инфекции применяют живые и инактивировакные вакцины. Отработана технологическая схема изготовления как моновалентных инактивированных форм вакцин против ИБ, БН, ИББ, синдрома снижения яйценоскости. Испытания поливалентной вакцины показали наличие высокого уровня AT к вирусам ИБ, БН, ИББ, ССЯ76 после вакцинации инактивированными вакцинами. Специфическая профилактика болезни включает применение живых и инактивированных вакцин: первые - в стадах бройлеров и ремонтного молодняка мясных и яичных кур (первичная обработка), вторые - в стадах кур-молодок в возрасте 14-18 недель. Во ВНИИЗЖ налажено производство живой вакцины из штамма Н-120. Для создания длительного и напряженного иммунитета против инфекционного бронхита кур (ИБК) в стадах яичной и мясной птицы проводят комплексную обработку 2-3 раза живой вакциной в возрасте 1 - 14 недель, а затем инактивированной - в 14-18 недель. При вакцинации против ИБК, Вызванного вариантными штаммами вируса, рекомендуют использовать инактивиро-ванную вакцину. В указанном институте разработана технология инактивированной моновалентной вакцины против ИБК и ассоциированной против ИБК, Болезни Ньюкасла и синдрома снижения яйценоскости.
Применение инактивированных вакцин. Достаточно эффективными оказались эмульгированные вакцины из концентрированного вируса. Введение инактивированной вакцины в 3- и 16-недельном возрасте дало такой же эффект, как и прививка живыми вакцинами: первый раз вакциной Н-120 (120 в КЭ) и вакциной из шт. Н52 (52-й пассаж вируса в КЭ). Наиболее выраженный иммунный ответу 100 % цыплят получен при вакцинации в 3-недельном возрасте живой вакциной из шт. Н120, а в 16-недельном возрасте - инактивированной эмульсинвакциной. Рекомендовано при конструировании инактивированных вакцин против ИБ использовать несколько штаммов (создавать поливалентную вакцину). Приготовленная в Китае вакцина против ИБК из штамма D и инокулированная цыплятам через 10-14 дней индуцировала антитела к ВИБК, которые обнаруживались через 21 день у 85 % птиц; вторая инокуляция, проведенная через месяц, защищала к 6 месяцу 87-100 %.
Применение живых вакцин. Штаммы, полностью утратившие вирулентность, практически неиммуногенны. Поэтому живые вакцины готовят из аттенуированных штаммов, обладающих различной степенью остаточной вирулентности. Для первой прививки применяют более аттенуированные и менее иммуногенные штаммы, для второй - более вирулентные. Живые вакцины применяют орально ( с питьевой водой) или путем закапывания в нос. Введение живой вакцины в зоб цыплятам создавало устойчивость к заражению без образования циркулирующих AT. Эти данные свидетельствуют О Важной роли местного иммунитета при ИБ. Материнские AT от иммунных кур-несушек передаются через яйцо цыплятам, которых они защищают в первые 2-4 недели жизни от ИБ. Период полужизни материнских AT составляет немногим более 5 дней. Со второй недели жизни титр их начинает снижаться. Оптимальный возраст для вакцинации цыплят живыми вакцинами составляет 2-3 недели. Учитывая корреляцию титра ВНА в сыворотках крови кур-несушек и в желтке яиц, предложено использовать последние для оценки иммунитета в РН. Яйца, снесенные в течение 60 дней, после повторной вакцинации содержат высокий уровень (концентрацию) AT.
Последовательная вакцинация живыми вакцинами разных типов обеспечивает накопление в сыворотке крови птиц широкого спектра AT, которые превосходили даже типы, примененные для вакцинации. Полученный от иммунизации против ИБ молодняк за счет материнских AT IgG-класса устойчив к заражению патогенным вирусом. Вирусспецифический IgG обнаружен и в желтке яиц больных И Б кур в течение 60 дней. Определяли эффективность живых аттенуированных вакцин Ма5 и 4/91 против нефропатогенной линии ВИБ (ИВ, В1,648). По каждому параметру одна вакцина Ма5 обладала плохими защитными свойствами. Вакцина 4/91 одна или в комбинации хорошо защищала почки цыплят-бройлеров.
Сотрудниками ВНИВИП создана живая вакцина из аттенуированного штамма ВИБ. В неблагополучных пунктах иммунизируют всех цыплят в 10-15-дневном возрасте двукратно через 14-15 дней. Ревакцинируют птиц в 100-120-дневном возрасте. Вакцину вводят интраназально или с питьевой водой. В последние годы в России применяют вакцины против ИБ производства различных зарубежных фирм.
Температурочувствительный мутант ВИБ (тип Арканзас) получен путем серийного пассирования при пониженной температуре (35-28 град.С). Вирус, в основном, размножался в верхних дыхательных путях и очень слабо в других органах. Он оказался авирулентным для 3-7-дневных цыплят-бройлеров. Доза вакцины, обеспечивающая 100 % защиту привитой птицы, составляла 103- 105 ЭИД50- Вакцинация 2-недельных цыплят аэрозольно или закапыванием в глаз вакцины из шт. Н120 создавала устойчивость примерно к 31-му дню.
При оценке различных программ вакцинации против ИБ в компании Питман Моор сравнивали титры AT в реакциях задержки гемагглютинации и нейтрализации. Цыплят первый раз иммунизировали в возрасте различными живыми вакцинами, а повторно - в 16-недельном возрасте инактивированными адьювант вакцинами из шт. М41 или GV101. В итоге установлено, что уровень AT у привитых цыплят был выше к вирусу М41, чем к вирусу серотипа Д207. У птиц, иммунизированных вакциной из шт. М41 и ревакцинированных убитой вакциной из двух штаммов, имелись более высокие титры AT к серотипам Массачусетс и Д207. Аттенуированные вакцинные шт. Массачусетс 33 и HI20 персистируют в трахее и легких с 3 до 13 дней после вакцинации.
Эффективность живых аттенуированных вакцин Ма5 и 4/91 против нефропатогенной линии вируса инфекционного бронхита (ВИБ) изучали по макро - и микроизменениям в почках, используя ПЦР для определения РНК ВИБ в ткани почек. По каждому параметру одна вакцина Ма5 обладала плохим защитным свойством. Вакцина 4/91 одна или в комбинации хорошо защищала почки цыплят бройлеров. Сообщается о конструировании рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего гликопротеин S1 изолята SD/97/01 вируса инфекционного бронхита. Методом обратной транскрипции-ПЦР амплифицированакДН К длиной 1,5 т. п. н., содержащая ген нуклеокапсидного белка N китайского изолята ВИБ и клонирована на векторе pUCl 19. Полученная плазмида охарактеризована методами рестрикционного анализа, дот-гибридизации и Саузерн-блот-гибридизации.
Связь титров антител с резистентностью. Нет прямой зависимости напряженности иммунитета от уровня ВНА. В резистентности птицы важную роль играет местный тканевой иммунитет респираторного тракта. Цыплята, вакцинированные аэро-зольно живым вирусом, резистентны, даже если в сыворотке крови нет специфических AT. Установлена прямая зависимость между устойчивостью птицы к заражению вирулентным вирусом и наличием обширных гистопатологических изменений в гарднеровых железах после вакцинации.
Оценку степени иммунитета у вакцинированных цыплят можно проводить по активности реснитчатого эпителия трахеальных эксплантатов, полученных после трахеального контрольного заражения. Интраназальная или интраокулярная иммунизация суточных цыплят с наличием материнского иммунитета вакцинным шт. Н120 обеспечивает устойчивость против интратрахеального заражения патогенным ВИБ. Эффективность вакцинации против ИБ вакцинами из шт. Массачусетс и Арканзас оценивается на основании выделения ВИБ из трахеальных тампонов после недельного периода заражения в полевых условиях.
Установлена иммунологическая совместимость вирус-вакцины из шт. Н120 ВИБ и вирус-вакцины из шт. Бор74 ВГНКИ вируса НБ при ассоциированном применении аэрозольным способом. Продолжительность иммунитета против ИБ и НБ составляла 120 дней.
Попытка разработать способ вакцинации против ИБ in ovo не дала явно положительных результатов. Вакцины Iboral 1 или Bioral H120 приводили к развитию лишь незначительных поствакцинальных реакций со стороны респираторной системы у вылупившихся цыплят. На 15-й день после вакцинации (12-й день после вылупле-ния) в сыворотках цыплят определялись повышенные титры AT в РЗГА по сравнению с контролем. Вакцина iboral 1 приводила к некоторым нарушениям диаграммы вы-лупления.
Серологическая оценка поствакциншьного иммунитета. Эффективность вакцины оценивается по разным критериям, из которых основным являются клинический ответ, носительство и диссиминация вируса, реакция трахеального эпителия in vivo и in vitro, защита от вирулентного гомологичного и гетерологичного типов ВИБ, образование секреторных и гуморальных AT Для оценки профилактической эффективности вакцинации цыплят против И Б предложен клиренс-тест.
Высокий уровень AT достигается к концу 3-й недели и регистрируется в течение года. На прививку инактивированной вакциной ВНА в сыворотках крови цыплят и кур появляются с 7-14-го дня в титрах 5-7 log2, нарастают к 30-60-му дню до 8-10,5 log2 и сохраняются на таком уровне до 6 месяцев.
В желтке яиц, полученных от кур-реконвалесцентов, имеются AT, которые затем передаются цыплятам. Уровень их у цыплят сразу же после вылуплен ия высокий, затем в течение 4 недель постепенно снижается. Пассивные AT не предотвращают респираторную инфекцию у цыплят, но несколько ослабляют течение болезни. Материнские AT обеспечивали устойчивость цыплят к заражению в течение 3 недель.
Для определения напряженности иммунитета у вакцинированной птицы после ее заражения вирулентным вирусом предложен метод выявления вирусного АГ с помощью флюоресцирующих AT Кроме того, предложена оценка поствакцинального иммунитета на основе активности ресничек в кольцах трахеи. При изучении гуморального иммунитета установлена тесная корреляция между активностью реснитчатого эпителия и выделением вируса из тканей, что послужило основанием рекомендовать первый тест в качестве критерия оценки местного иммунитета при определении перекрестного иммунитета. Однако корреляция между уровнем AT и численностью подверженных к заражению ВИБ птиц незначительна. Резистентность связана с клеточным опосредованным иммунитетом, что подтверждено методом бласттрансформации лимфоцитов и реакцией гиперчувствительности замедленного типа.
Оценка иммунитета у птиц, привитых инактивированными вакцинами, основана на обнаружении ВНА и ПА. Обычно через 2 недели после второй вакцинации индекс нейтрализации составляет 3 lg. С помощью ИФА можно достоверно оценить как поствакцинальный, так и постинфекционный статус у экспериментально зараженных птиц. Метод не является специфическим для серотипирования ВИБ, но высокочувствителен для выявления AT в сыворотке крови. Данные, полученные методом ИФА при оценке иммунного статуса, хорошо совпадают с результатами, полученными в других серологических реакциях: РН, РЗГА, вирусовыделения и реакции ткани трахеи.
Установлена тесная корреляция между активностью мерцательного эпителия и гистологическими изменениями, вызванными вирусом, и незначительная - между титрами AT (в РН и РИГА) и напряженностью иммунитета. Однако не установлено корреляции между показателями клеточного и гуморального иммунитета у цыплят, иммунизированных инактивированной эмульсинвакциной. Установлена корреляция титров ВНА в сыворотках крови и желтках яиц и вакцинированных кур.
