Концентрация спермы животных

Определение густоты спермы путем глазомерной оценки дает приблизительное представление о количестве спермиев в сперме. Чтобы точно рассчитать, во сколько раз можно разбавить свежеполученную сперму, сколько самок можно осеменить одним эякулятом и чтобы определить дозу спермы для осеменения самок, нужно знать концентрацию спермы.

Концентрация - это количество спермиев в 1 мл спермы, выраженная в миллионах (жеребец, хряк) или в миллиардах (баран, бык).

К разбавлению и хранению допускают сперму сельскохозяйственных животных и птицы с такой концентрацией:

Вид Минимально допустимая концентрация животных (млрд./мл)

Баран 2,0

Бык 0,8

Жеребец 0,15

Хряк 0,15

Петух, индюк 2,0

Гусь 0,4

Сперма животных, концентрация которой ниже этих показателей, к разбавлению и хранению не допускается и бракуется.

Концентрация спермы зависит от многих факторов: условий кормления и возраста, содержания, режима использования производителя, его индивидуальных особенностей, а также времени года.

Многие исследователи отмечают, что качество спермы зависит от возраста быков-производителей. С возрастом увеличивается объем эякулята, переживаемость спермиев.

По мнению других авторов качество спермы, в том числе и концентрация, очень зависит от времени года. В летние месяцы концентрация спермы снижается, а осенью и зимой – увеличивается.

Методы определения концентрации спермы

• Концентрацию спермы можно определять при помощи счетных камер (Горяева, Бюркера, Предтеченского, Тома-Цейса, Фукс-Розента-ля), а также по оптическим стандартам, на фотоэлектрокалориметре и на фотоэлектрическом гемометре.

Определение концентрации спермы при помощи счетной камеры

 

Ее проводят в такой последовательности:

а) подготовка счетной камеры;

б) разбавление спермы в смесителе (меланжере);

в) заправка камеры разбавленной спермой;

г) подсчет спермиев в счетной камере;

д) определение концентрации спермиев в исследуемой сперме.

Подготовка счетной камеры. Камера Горяева состоит из толстого предметного стекла, на котором имеется три площадки, которые разделены прорезями. Средняя площадка разделена прорезями на две другие и опущена на 0,1 мм ниже, чем боковые (в некоторых камерах она ниже на 0,2 мм). Эта цифра нанесена на камере. На каждой из средних площадок нанесена квадратная сетка площадью по 9 мм, которая состоит из 225 больших квадратиков, 25 из которых (по 5 в ряду) разделены продольными и поперечными линиями на 16 маленьких квадратиков. Большой квадрат равный по площади 16 маленьким. Каждая сторона малого квадрата равна 1/20 мм, а площадь - 1/400 мм.

Камеру и покровное стекло тщательно моют водой и досуха вытирают чистой салфеткой. Покровное стекло (лучше шлифованое) кладут на опорные площадки, притирают стекло до появления в местах касания стекла с площадками радужных (ньютоновых) кол. Пальцы при этом не должны сближаться, так как покровное стекло может треснуть. После притирки покровного стекла над сеткой появляется капиллярная полость глубиной (высотой) 0,1 мм.

Разбавление спермы в смесителе (меланжере)

Перед заправкой камеры сперму разбавляют 3%-ным раствором кухонной соли. Растворитель одновременно убивает спермии и они становятся неподвижными. Разбавление проводят в эритроцитарных (сперма барана и быка) или лейкоцитарных (сперма жеребца и хряка) смесителях (меланжерах). Разбавляют сперму еще и потому, что в неразбавленной сперме спермии в сетке лежат густо и их подсчет вести очень сложно.

Таблица 2 - Степень разбавления спермы для подсчета спермиев

Сперма животных	Смеситель	До какой метки набирать		Степень разбавления
		сперму	раствор
Барана	Эритроцитарный	0,5	101	200
Быка	Эритроцитарный	1,0	101	100
Хряка	Лейкоцитарный	0,5	11	20
Жеребца	Лейкоцитарный	0,5	11	20

Смесители (меланжеры) должны быть чистыми и сухими, для чего их сразу после каждого подсчета промывают дистиллированной водой, потом (для обезжиривания и удаления воды) обрабатывают спиртом и эфиром, а затем высушивают, продувая через смеситель воздух резинового баллона. После разбавления спермы концы меланжера зажимают большим и указательным пальцами и переворачивают в течение 2-3 минут, чтобы смешать сперму с раствором соли. Этому помогает бусинка в смесителе.

Счетные камеры и шлифуемые покровные стекла также должны быть чистыми и сухими. Счетную камеру и шлифуемое покровное стекло моют теплой проточной водой, потом промывают дистиллированной водой и досуха вытирают чистой сухой марлевой салфеткой. Протирать счетную камеру спиртовым тампоном или спирт-эфиром (в равных частях) нельзя, так как может раствориться канадский бальзам, которым прикреплены сетки к площадкам камеры.

Заправка счетной камеры разбавленной спермой

Заправлять счетную камеру разбавленной спермой необходимо сразу же после перемешивания. Если это позже, то спермии начнут оседать, что приведет к грубым ошибкам при определении концентрации. Первые 4-5 капель из смесителя, в которых нет спермиев, выпускают в чашку, а следующую каплю осторожно выпускают под притертое к камере покровное стекло. В капле не должно быть пузырьков воздуха.

Когда на средней площадке рядом с щелью камеры остается большая капля жидкости, ее нужно осторожно забрать ватой, чтобы устранить колебание жидкости в камере.

Заправленую камеру кладут на столик микроскопа в строго горизонтальном положении, наводят микроскоп и подбирают оптимальное освещение. Рекомендуется сначала найти сетку камеры при малом увеличении (в 120-200 раз), а потом установить увеличение в 300-400 раз.

Подсчет спермиев в камере Горяева

Спермии подсчитывают в 80 малых квадратах, то есть в пяти больших, которые лежат по диагонали сетки (в других камерах необходимо брать еще один квадрат сбоку). Считают спермии, головки которых находятся в середине квадрата, а также на левой и верхней линиях квадрата.

Результаты подсчета в каждом большом квадрате записывают отдельно,а потом суммируют. Для точности определения концентрации рекомендуется подсчет спермиев проводить два раза (в обоих сетках), их разница не должна превышать 10%. Если расхождение результатов будет больше 10%,то счетную камеру заполняют опять из того же смесителя после переворачивания и подсчет повторяют. Для определения числа спермиев берут среднее из двух подсчетов, которые отличаются не более, чем на 10%.

Определение концентрации спермиев в исследуемой сперме проводится по формуле:

С=№×Д×400/н×р×1000000, где

С - концентрация спермы, млрд./мл

№ - число подсчитанных спермиев

Д - степень разбавления спермы в смесителе

н - число малых квадратиков (80)

р – глубина счетной камеры

400 - множитель, введенный в формулу для пересчета на 1 мм²

1000000 – для выражения в млрд./мл, поскольку в 1мл есть 1000 микрометров (мм ³)

80 - количество малых квадратов.

Можно проводить также вычисление концентрации спермиев и по другой формуле:

С=Н×Д×4000×1000/80, где

С - концентрация спермы, млрд./мл

Н - количество подсчитанных спермиев

4000 - множитель, введенный для пересчета на 1 мм³

1000 - множитель для пересчета на 1 мл

80 - количество малых квадратиков '

Д – степень разбавления спермы

Если глубина камеры 0,1 мм, спермии подсчитаны в 80 малых квадратах, а разбавление проведено в соответствии с таблицей, то концентрацию спермиев можно определить по упрощенной формуле путем деления количества подсчитанных спермиев в 80 малых квадратах в сперме быка - на 200, в сперме барана и птицы - на 100, в сперме хряка и жеребца - на 1000. При делении получим цифру, которая выражает концентрацию спермиев в млрд./мл. Упрощенные формулы выведены из основной формулы.

После завершения работы из смесителей изымают сперму, сразу промывают их несколько раз дистиллированной или кипяченой водой, 96%-ым этиловым спиртом и эфиром, а высушивают путем продувки воздуха при помощи шаров Ричардсона или спринцовки.

Счетные камеры и шлифуемые покровные стекла после работы тщательно моют сначала простой, а затем дистиллированной водой и досуха вытирают марлевой салфеткой.

Метод прямого подсчета спермиев в счетной камере является наиболее объективным и точным, но он занимает даже у опытных лаборантов по 10-15 минут времени и при необходимости определить концентрацию спермы от большого количества производителей очень задерживает технологию обработки спермы.

Определение концентрации спермиев методом стандартов

Сейчас разработаны и используются на практике и другие методы определения концентрации спермиев, которые базируются на оценке прозрачности спермы. Эти методы менее точные, так как на прозрачность спермы кроме спермиев оказывают влияние и другие факторы (корма, эпителиальные клетки).

Используя оптические стандарты приблизительно определяют концентрацию спермиев в сперме быка, жеребца и хряка.

Стандарты - это запаяные стеклянные пробирки с мутной жидкостью, которая по виду напоминает сперму этих животных.

Для определения концентрации спермы жеребца Г.В.Паршутин и С.О.Румянцева предложили этот метод стандартов, которые состоят из шести небольших одинакового диаметра запаянных пробирок (эталонов) с мутной жидкостью (тальк в дистиллированной воде), которая по внешнему виду напоминает сперму жеребца. В каждой пробирке жидкость по мутности отвечает сперме с концентрацией в 10, 50, 100, 200, 300, 1500 миллионов спермиев в 1мл. К стандартам прилагаются две пустые пробирки такого же диаметра, как и пробирки с жидкостью.

Для определения концентрации в чистую пустую пробирку наливают 1,5-2,0 мл исследуемой спермы жеребца. Все стандартные пробирки хорошо встряхивают и сравнивают, глядя на свет, с пробиркой со спермой. Подбирают стандарт, который наиболее близок по мутности к исследуемой сперме. Указанную на пробирке концентрацию принимают за концентрацию исследуемой спермы в миллионах. Когда же мутность спермы окажется промежуточной между двумя стандартами, то за концентрацию принимают среднее число между показателями этих двух пробирок.

Если сперма густая и концентрация спермиев больше 500 млн./мл, то ее можно разбавить 7%-ым раствором глюкозы в два раза (1:1), а затем определить концентрацию по стандартам, умножив на 2 полученный результат

Стандарты для спермы быка состоят из 5 запаянных пробирок, жидкость в которых по мутности отвечает концентрации 400, 600, 800 млн., 1 и 2 млрд./мл. Сперму быка предварительно разбавляют в соотношении 1:5 1%-им раствором натрия хлорида. Потом определяют концентрацию так же, как описано выше.

Стандарт С.И.Сердюка предложен для определения концентрации спермы хряка. В чистую пустую пробирку такого же диаметра, как и стандарт, наливают 1 мл чистого 1%-ного раствора натрия хлорида. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной через 4-6 слоев марлю спермы хряка. Край микропипетки, который погружался в сперму, вытирают снаружи марлевой салфеткой и вносят сперму в пробирку с физраствором натрия хлорида. Микропипетку промывают 1-2 раза в физрастворе. Пробирки со стандартной жидкостью и спермой несколько раз встряхивают и плотно прикладывают позади к обоим пробиркам газетный или книжный текст для выяснения, одинаковая или нет оптическая плотность исследуемой спермы и стандарта. Если плотность не одинаковая, то к сперме добавляют пипеткой 1%-ной раствор натрия хлорида небольшими порциями, встряхивая каждый раз содержимое пробирок до уравнивания оптической плотности исследуемой спермы и стандартов (то есть видимость через жидкость букв в обоих пробирках будет одинакова).

Концентрацию (С) спермиев определяют по формуле:

С=50×(н×0,1), где

С – конценрация спермы, млн./мл;

Н – объем добавленого раствора натрия хлорида, мл;

50 – коэфициент.

Стандарт отвечает оптической плотности спермы хряка с концентрацией спермиев 5 миллионов в 1 мл спермы.

Пример. Если к исследуемой сперме добавлено 4,5 мл 1%-ного раствора натрия хлорида (с учетом 1 мл раствора ранее налитого в пустую пробирку), то С = 50×(4,5+0,1) = 50x4,6 = 230 млн./мл.

Определение концентрации спермиев при помощи фотоэлектрокалориметра

Подсчет спермиев в счетной камере занимает очень много времени. Чтобы ускорить определение концентрации спермиев, применяют фотоэлектрокалориметр ФЕК-М. Точность определения такая же, как и при использовании счетной камеры, но затраты времени всего
1-2 минуты. Суть метода - это определение оптической плотности
спермы, величина которой пропорциональная концентрации спермиев.

Перед тем, как определять концентрацию спермиев при помощи ФЕК-М, нужно построить градуируемую кривую, которая изображает зависимость оптической плотности от концентрации спермиев.

Для построения кривой берут эякулят с концентрацией спермиев выше 1 млрд. в 1 мл, из которого делают разведения с разной концентрацией (табл. 3).

Пример. Берут сперму с концентрацией спермиев 2 млрд./мл. Сперму разбавляют 3,5%-ым раствором натрия лимоннокислого из расчета приготовления разведений с интервалом концентрации спермиев в растворе от 0,02 до 0,2 млрд./мл.

Таблица 3 – Оптическая плотность спермы в зависимости от концентрации спермиев

Номера пробирок	Количество спермы, мл	Количество натрия лимоннокислого	Концентрация спермиев в растворе, млрд./мл	Величина оптической плотности на ФЭК-М
1	1,0	9,0	0,2	1,0
2	0,9	9,1	0,18	0,9
3	0,8	9,2	0,16	0,8
4	0,7	9,3	0,14	0,7
5	0,6	9,4	0,12	0,6
6	0,5	9,5	0,1	0,5
7	0,4	9,6	0,08	0,4
8	0,3	9,7	0,06	0,3
9	0,2	9,8	0,04	0,2
10	0,1	9,9	0,02	0,1

Концентрацию спермиев в каждом разведении уточняют, подсчитывая их количество в счетной камере. Величину оптической плотности приготовленных разведений определяют на фотоэлектрокалориметре при красном светофильтре в кювете с рабочей длиной 10 мм.

Для построения градуированного графика откладывают на оси абсцисс значение концентрации спермиев, а по оси ординат соответствующие им величины оптической плотности. Градуированную кривую проводят через полученные точки. Кривая должна более или менее приближаться к прямой. Градуированный график строят для каждого прибора. Проверку графика проводят каждый месяц. Для определения концентрации прибор включают за 15-20 мин. до начала работы. Устанавливают красные светофильтры. Показания фотоэлектрокалориметра устанавливают на «ноль». Во флакони из-под антибиотиков (количество которых должно отвечать числу исследуемых эякулятов) вносят пипеткой по 9,9 мл 3,5% раствора натрия лимоннокислого и закрывают пробками. Температура раствора должна быть 18-25°.

При исследовании каждого эякулята во флакон с раствором вносят микропипеткой 0,1 мл спермы быка, разбавляя ее в соотношении 1:100. Сперму барана разбавляют в соотношении 1:400, а сперму хряка - 1:30. Набирать сперму в микропипетки нужно с максимальной точностью. Выдув сперму в раствор, промывают пипетку 3-4 раза тем же раствором из флакона.

После разбавления сперму старательно перемешивают с раствором и наливают в кювету с рабочей длиной 10 мм до метки. Две такие же кюветы заполняют до метки раствором без спермы. Потом на приборе измеряют величину оптической плотности разбавленной спермы и по градуируемой кривой определяют концентрацию спермиев. Чтобы окончательно определить концентрацию, нужна величина концентрации спермиев в растворе натрия лимоннокислого, которую нашли при помощи градуируемого графика, умноженную на 10.

Для определения количества спермиев в эякуляте необходимо концентрацию спермиев в 1 мл умножить на количество спермы в эякуляте.

 

Определение концентрации спермиев фотоэлектрическим гемометром

Сначала согласно с инструкцией подготовить прибор к работе. До включения прибора в электрическую сеть рукояткой «установка ноля» переводят стрелку микроамперметра на ноль. Устанавливают на ноль по градусной шкале (самой нижней) шкалу счетного барабана. Ставят в положение Е переключатель рода работ. Потом устанавливают инфракрасный фильтр. В гнездо прибора устанавливают кювету с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого, налитого до отметки. Включают прибор, заменяют кювету с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого на контрольный фильтр Е. Стрелка гальванометра при этом отклонится влево. Рукоятку счетного барабана поворачивают по часовой стрелке и устанавливают микроамперметр на ноль. Записывают отсчет по часовой стрелке, при котором стрелка гальванометра станет на ноль. Этот отсчет будет контролем правильности настройки прибора для выведения градуированной кривой.

Сначала исследуют 15-20 образцов спермы с известной концентрацией, придерживаясь нижеуказанного разведения. Зная их концентрацию по счетной камере, строят градуированную кривую и выводят по ней таблицу зависимости показаний прибора от концентрации спермиев. При исследовании спермы делают следующие разведения: для спермы быка – 1:200, барана – 1:400, хряка – 1:30.

Концентрацию спермиев определяют по градуированной кривой или по таблице. Для этого достаточно исследовать пробу спермы на приборе указанным выше методом и по полученному отсчету установить концентрацию спермиев в сперме.