Парагрипп-3 крупного рогатого скота
[Parainfluenza-3]
Парагрипп-З (ПГ-3) КРС (транспортная лихорадка КРС, параинфлюэнца-3) — острая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания.
Впервые ее описали в США в 1932 г., установив при этом роль пастерелл в этиологии болезни. Представление об этиологии болезни изменилось в 1959 г., когда от больных телят был изолирован вирус, сходный по АГ-структуре с вирусом ПГ-3 человека. Вирус впервые выделили и описали Рейзенгер и Хедделсон в 1959 г. В СССР ПГ обнаружен в 1968 г. В настоящее время болезнь зарегистрирована во всех странах мира, где развито промышленное животноводство.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Диапазон проявления болезни разнообразен: от легких ринитов или бронхитов до тяжелой бронхопневмонии. Течение болезни обусловливается многими факторами: способом заражения животных, их иммунным и физиологическим состоянием, вирулентностью штамма. Ввиду того, что симптомы ПГ-3 сходны с клиническими проявлениями ВД-БС, ИРТ, аденовирусной инфекции и хламидиозов, клиническое течение болезни изучали путем постановки опытов на телятах-гнотобиотах. Инкубационный период болезни длится 24—30 ч. Клинические признаки проявляются через 24—36 ч после введения вируса. Первые симптомы — повышение температуры тела и серозные истечения из носа. Максимально температура повышается на 3—5-й день до 40,9—41,5 °С, нормализуется на 7—10-й день. У животных выражены угнетение, одышка, кашель, серозно-слизистые истечения из носа, которые переходят в гнойные, дыхание поверхностное и частое, хрипы продолжаются до 12—14-го дня. Животное отказывается от корма. Если нет осложнений секундарной бактериальной микрофлорой, через 2—3 недели наступает выздоровление.
В естественных условиях животные имеют AT, но вирус способен вызывать инфекцию. В зависимости от титра AT проявляется реакция. Наиболее продолжительное выделение вируса наблюдается у телят, не имеющих AT. В естественных условиях заболевание существенно отличается от экспериментального, так как может наблюдаться присутствие нескольких вирусных агентов, осложнение стрессовыми факторами, снижающими резистентность организма и соответствующими секундар-ными инфекциями. У телят при подостром и хроническом течениях отмечают слизисто-гнойные выделения из носа и глаз, признаки пневмонии и плеврита, иногда энтериты. При вскрытии: бронхопневмонию, плеврит, фибринозный перикардит, иногда гидроторакс, гнойное воспаление кишечника.
У буйволов болезнь сопровождается поражением органов дыхания и диареей, у молодняка наблюдается взъерошенность, а иногда и выпадение шерстного покрова. На исход болезни влияют вирулентность циркулирующего штамма вируса и факторы, осложняющие течение болезни. Тяжелое течение болезни, приводящее животных к гибели, — результат одновременного инфицирования вирусом ПГ-3 и пастерелла-ми, а также воздействия стрессов; в то же время, каждый фактор в отдельности не приводит к столь тяжелому течению болезни. У взрослых животных болезнь, как правило, не сопровождается симптомами респираторного заболевания. У стельных коров инфекция может привести к внутриутробному заражению плода, абортам или рождению нежизнеспособных телят.
Патологоанатомические изменения, в основном, наблюдаются в органах дыхания: катаральное воспаление слизистой оболочки верхнихдыхательных путей; в течение 7—9 дней (в острый период) слизистая оболочка отечна, гиперемирована. В полостях носа и околоносовых пазух слизисто-гнойный, в просветах трахеи и бронхов се-розно-гнойный экссудат. В брюшной и грудной полостях скапливается серозный экссудат. Отмечается бронхопневмония. Пораженные участки от сине-красного до серого цвета, увеличены, плотны. Поверхность разреза влажная, при надавливании отделяется большое количество мутной жидкости. Средостенные лимфоузлы отечны и пронизаны кровоизлияниями. Обильные точечные и пятнистые кровоизлияния находят в тимусе, на плевре, брюшине, эпикарде. На слизистой оболочке сычуга, кроме кровоизлияний, наблюдают также эрозии и язвы. Слизистая оболочка кишечника отекшая и с кровоизлияниями.
Морфология и химический состав. Морфология ВПГ-3 сходна с таковой вируса НБ. О существовании пяти структурных белков вируса было известно ранее: — фос-фопротеин (Р, Мол. м. 83 кД), ГА-нейраминидазный гликопротеин (HN, мол. м. 69 кД), главный нуклеокапсидный протеин (NP, мол. м. 66 кД), гликопротеин (F, мол. м. 55 кД), матричный белок (М, мол. м. 38 кД). Шестой белок L (мол. м. 180 кД) является, очевидно, полимеразой. Клеточный активный белок А(мол. м. 43 кД), ассоциированный со многими оболочечными вирусами, обнаружен как седьмой белок.
ВПГ-3 не обладает высокой устойчивостью, быстро разрушается под действием высокой температуры и УФ-излучения. При 37 °С титр вируса в течение 2—4 суток снижается на 1—3,5 lg ТЦД; прогревание при 56 °С в течение 30 мин ведет к утрате инфекционной и ГА-активности. Вирус инактивируется в условиях нагревания при 60 °С в течение 30 мин, при 50 °С — за 120 мин, при обработке 0,5 %-ным раствором формалина и 1 %-ным раствором (3-пропиолактона повреждаются ГА и уничтожается инфекционность вируса; 0,2 %-ный раствор додецилсульфата натрия и 1 М раствор MgCb снижает как инфекционную, так и ГА-активности. Обработка 0,4 %-ным этиленимином в течение 20 ч не действует на ГА-активность, но уничтожает инфекцион-ность вируса. Под воздействием жирорастворителей (хлороформа, эфира) полностью теряется инфекционная активность вируса. Раствор (8 М) мочевины уничтожает ГА-активность вируса. Дезоксихолат натрия при 37 °С в течение 1 ч действует на вирус слабее: при концентрации 0,1 % титр ГА снижался в 8 раз, а инфекционный титр падал на 5—6 lg ТЦД50. ЭМ показала, что детергент растворяет только липиды, оставляя в свободном виде ГА. На вирус губительно действуют низкие значения рН: при 6,8—7,5 он хорошо сохраняется, но при рН 3,4 быстро инактивируется. Изучено влияние температуры и относительной влажности на выживаемость ВПГ-3 в аэрозоле. Наибольшая стабильность его в аэрозоле наблюдалась в среде Игла при 6 °С и относительной влажности 30 %.
Антигенная структура, вариабельность и родство. ВПГ-3 обладает выраженной АГ-активностью и имеет два типа АГ, различающихся по свойствам и специфичности: рибонуклеопротеидный, или S-АГ, и поверхностный V-АГ. 1-й обнаруживается в РСК, 2-й - в РСК и РТГА.
АГ-вариабельности штаммов вируса ПГ-3 не установлено. Все штаммы в разных странах от телят и взрослых животных по АГ - структуре идентичны и соответствуют прототипному шт. SF-4, выделенному в США. Установлены различия в вариантах вируса ПГ-3 по ГА-, нейраминидазной и синцитий-образующей активности. Вирусы ПГ-3 КРС и человека АГ сходны между собой. Их прототипные штаммы различаются между собой в перекрестной РЗГА только 4-кратно. В HN-АГ идентифицировано шесть АГ-сайтов, три из которых связаны с нейтрализацией и содержат 11 эпитопов. HN-гликопротеины вирусов ПГ-3 человека и КРС имеют три общих эпитопа. Остальные 10 HN-эпитопов ВПГ-3 человека у ВПГ-3 КРС отсутствуют. У обоих вирусов обнаруживается значительная консервативность и гомология в аминокислотной последовательности NP-, Р-, С - и М-белков. ПГ-3 КРС отличается от вируса ПГ-3 человека по белку HN. Однако белок F ПГ-3 КРС имеет 80,44 и 22 % гомологии с аналогичными белками ПГ-3 человека, вирусов Сендай и НБ.
С помощью ПЦР и последующего секвенирования фрагментов гена HN показана возможность индикации и штаммовой дифференциации вируса парагриппа-3 КРС. Нуклеотидная последовательность на анализируемом участке гена HN у двух изоля-тов полностью идентична с таковой производственного штамма SF-4/32 вируса ПГ-3. Уровень различий между штаммом SF-4/32 и тремя другими изолятами вируса составил около 8 % при сравнении нуклеотидных последовательностей и около 4 % При сравнении аминокислотных последовательностей. Показана возможность использования амплификации фрагмента гена HN в сочетании с нуклеотидным секвенирова-нием к ДНК для индикации и штаммовой дифференциации вируса ПГ-3 КРС. Сравнительный анализ первичной структуры изучаемого фрагмента гена HN показал, что среди исследованных штаммов и изолятов вируса выделяются две генетические группы. Одну из них образуют североамериканские штаммы вируса и российские изоляты, первичная структура которых имеет высокий уровень гомологии с первичной структурой штамма SF-4/32, а другую — российские изоляты вируса, имеющие высокий уровень гомологии данного фрагмента с последовательностями японских штаммов.
Вирус ПГ-3 относится к возбудителям, которые оказывают прямое воздействие на респираторный тракт. При попадании в носовую полость или другие участки дыхательной системы вирионы внедряются в эпителиальные клетки, где они быстро размножаются. Затем большое число их выделяется на поверхность слизистых оболочек, поступает в слизь, тем самым разрушая важный защитный барьер — слизистую оболочку, что создает благоприятные условия для секундарной микрофлоры. Движение слизи и воздуха способствует распространению вирусных частиц по всей дыхательной системе с последующим заражением других эпителиальных клеток.
ВПГ-3 удается изолировать от экспериментально инфицированных и естественно больных животных: через 1—9 дней после заражения — из экскретов респираторного тракта, через 3—10 дней — из гортани и трахеи, через 1 — 17 дней — из легких, в течение 2—4 дней — из миндалин и надгортанных, бронхиальных лимфоузлов; в течение 1—2 дней — из селезенки, печени, сердца, надпочечников. Его также изолируют из те-стикул теляти быков-продуцентов и часто из спермы быков-производителей.
Антигенная активность. АГ-активность штаммов не зависит от нейраминидазной активности. Как при естественной инфекции, так и при иммунизации появляются специфические AT, которые обнаруживаются в РН, РСК, РТГА, РДП. У экспериментально зараженных телят анти-ГА появляются первыми — на 6—7-й день, титр их быстро нарастает и в периоде 15-го по 21-й день достигает 1:256 и более, сохраняясь на этом уровне в течение 6 месяцев. ВНА играют незначительную роль в образовании иммунитета к ПГ-3, который обусловлен, главным образом, секреторными AT. При нормальном развитии беременности материнские AT не проникают через плацентарный барьер в эмбрионы. Поэтому присутствие специфических AT в сыворотке крови плода доказывает возможность внутриутробной инфекции.
Различные белки одного и того же вируса отличаются по АГ-активности, например, гликопротеины HN вируса ПГ-3 вызывали более выраженный АТ-ответ, чем гликопротеин F.
Экспериментальная инфекция. Лабораторные животные невосприимчивы. Заражение телят удается в случае отсутствия у них специфических AT. Пики цитотоксичности, которые колебались от 12 до 53 %, наблюдали на 6—9-й день после заражения при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 100:1. Гибель инфицированных вирусом ПГ-3 клеток не превышала 5 %.
Культивирование. ВПГ-3 хорошо размножается в первичных культурах клеток ПТ, ПЭК, легких и тестикул теленка; наиболее чувствительны клетки почки, легкого и тонкого кишечника, менее чувствительны клетки лимфоузлов, тестикул, тимуса и печени. В различных культурах клеток КРС все штаммы ПГ-3 вызывают сходное ЦПД, характеризующееся образованием синцития и вакуолей. Сроки проявления гемадсорбции и ЦПД зависят не от штамма, а от вида культуры клеток.
ВПГ-3 размножается в диплоидных перевиваемых культурах клеток: Hela, Hep-2, KB, МДВК, ВНК-21, Vero, АИ-ВЕК. В стационарных 2—3-суточных культурах MDBK и ПС (почка сайги) в течение 10 пассажей титр вируса ПГ-3 составлял 4,75—5,0 lg ТЦД50/МЛ и 7,0-7,5 lg ТЦД50/МЛ соответственно. ВПГ-3 размножается в КЭ, зараженных на ХАО, валлантдисную и амниотическую полости, накапливаясь в титрах 103—108<3 ЭИДго/мл-Однако зараженные эмбрионы не погибают, поэтому при первичном выделении вируса можно использовать КЭ, но для доказательства наличия его в экстраэмбриональной жидкости ее испытывают в культуре клеток почки теленка.
ВПГ-3 агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, обезьяны, коровы, мышей, голубя, буйвола, овцы, козы, плохо агглютинирует эритроциты человека и не агглютинирует эритроциты лошади. Данные об агглютинации эритроцитов кур противоречивы. Изучена антигенная структура и некоторые биологические характеристики гемагглютинина-нейраминидазы (HW) и гликопротеина слияния (F) вируса ПГ-3.
В основе явления гемадсорбции лежит сродство рецепторов ВПГ-3, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично РГА. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках уже через 4 ч после заражения. Клетки, инфицированные ВПГ-3, лучше всего сорбируют эритроциты морской свинки, слабее — эритроциты кролика, белой мыши и других животных. Вирус вызывает диффузную адсорбцию эритроцитов. Для постановки реакции используют 0,5 %-ную взвесь стерильно взятых и отмытых эритроцитов морской свинки, которые добавляют по 0,2 мл в пробирки с испытуемой клеточной культурой.
Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции — больные телята, которые в острой стадии болезни выделяют вирус в количестве 10б—107>5 ТЦДбо/мл - Заражение телят происходит воздушно-капельным путем и, возможно, перорально, так как установлено выделение вируса с молоком, фекалиями и вагинальными истечениями. Не исключается передача возбудителя и половым путем.
В естественных условиях ВПГ-3 вызывает заболевание у КРС, поражая до 90—100 % животных и обусловливая в 20—25 % случаев вспышки респираторных болезней. Парагриппом болеют телята не старше года. AT к ВПГ-3 обнаружены у 60—100 % клинически здоровых телят; они также выявляются у овец, коз и верблюдов. Ввиду широкого распространения ПГ-3 среди поголовья овец, рекомендуется регулярная вакцинация овец живой вакциной к ПГ-3 КРС. Имеются сообщения о выделении вируса ПГ-3 (шт. SF-4) от буйволов, лошадей, собак и крыс. Некоторые авторы считают, что при широком распространение ПГ-3 в хозяйствах РФ респираторными заболеваниями чаще болеет молодняк, переболевший диареей.
Иммунитет и специфическая профилактика. Для специфической профилактики ПГ-3 применяют живые и инактивированные вакцины. Однако последние пока еще не нашли широкого применения. Широкое использование живых вакцин против ПГ-3 более 20 лет показало их высокую эффективность. Кроме того, вследствие индукции интерферона они обладают лечебным эффектом и могут быть использованы в первые дни болезни животных с целью быстрого прекращения эпизоотической вспышки.
Независимо от способа введения живых вакцин рекомендуется двукратная иммунизация телят. Первая (за 2—3 недели до перевода на комплекс) — в 2—4-недельном возрасте и вторая — через 4 до 8 недель в комплексе. Телят, вакцинированных в неблагополучных стадах в возрасте 1—2 месяцев, через 4—8 недель ревакцинируют. Все чаще применяют живые комбинированные вакцины, содержащие аттенуированные штаммы вирусов ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и аденовироза. Иногда к таким вакцинам добавляют инактивированные пастереллы. Следует отметить, что интраназальная вакцинация не всегда создает достаточно выраженный иммунитет.
Не оставлена идея создания инактивированной вакцины против ПГ-3. В настоящее время ученые и практики высоко оценивают инактивированные вакцины, разработанные на основе новой технологии. Так, трехвалентная инактивированная вакцина из вирусов ИРТ и ВД-БС КРС, ПГ-3 зарекомендовала себя надежным препаратом Vira shield-4 TM.
В СНГ для профилактики ПГ-3 применяют живую вакцину «Паравак», изготовленную из авирулентного штамма вируса ПГ-3, а также бивалентную «Бивак» для одновременной профилактики ПГ-3 и ИРТ. Вакцины рекомендуют для интраназального введения.
При вакцинации молодняка КРС велико значение колострального иммунитета. Чем выше уровень молозивных AT, тем труднее добиться желаемого иммунизирующего эффекта при вакцинации. Колостральные AT даже в низких титрах (1:16) препятствуют активной продукции сывороточных AT в связи с блокированием вакцинного АГ. По этой причине рекомендуют прививать телят интраназально.
Молозивные AT в титрах 4,3—6,3 log2 ингибируют АГ-ответ у 2—2,5-месячных телят после подкожного введения вакцины. Однако при интраназальном введении вируса они практически не препятствуют образованию поствакцинальных анти-ГА, но чем выше уровень молозивных AT, тем менее выраженную сероконверсию наблюдают у привитых телят. Однократная вакцинация телят с молозивными AT не вызывает увеличения титров сывороточных AT Повышение уровня AT происходит только после ревакцинации, которая вызывает их быстрое накопление.
После заражения телят, получавших молозиво и вакцинированных живой вакциной типа 3 в возрасте 1 и 5 недель, клиренс вируса был более быстрым у вакцинированных телят. Функция отдельных альвеолярных макрофагов была заметно снижена у всех телят через 5—7 дней после заражения, хотя бактерицидная активность по сравнению с контролем не изменялась. Продукция нейтрофильных хемотактических факторов альвеолярными макрофагами проходила быстрее после нагрузки вирусом у предварительно вакцинированных телят и это коррелировало с более быстрым поступлением нейтрофилов в легкие этих животных. Установлено, что репликация штаммов «корабельной лихорадки» (SF) и Канзас (Ка) ПГ-3 у макак-резусов ограничена в 100—1000 раз по сравнению с ВПГ-3 человека. Сконструированы химерные рекомбинанты вируса ПГ-3 человека, у которых открытая рамка считывания (ОРС) нуклеокапсидного белка N заменена на ОРС N ВПГ-3 КРС штамма Ка или SF (cKa-N и cSF-N соответственно). Они репродуцируются в линиях клеток почек обезьяны (LLC-MK2) и MDBK до такого же титра, как и их «родители». Таким образом, гетерологичная природа нуклеокапсидного белка N не нарушает репликацию in vitro. Однако репликация cKa-N и cSF-N ограничена у макакрезусов так же, как репликация ВПГ-3 КРС. Это показало, что нуклеокапсидный белок N является детерминантом ограничения круга хозяев ВПГ-3 КРС у приматов. Тем не менее химерные вирусы вызывают такую же устойчивость к заражению макак ВПГ-3 человека, как и иммунизация самим ВПГ-3 человека.
Разработана и предложена эффективная схема лечебно-профилактических мероприятий при ИРТ и ПГ-3, обеспечивающая надежную защиту КРС от этих инфекций в течение не менее 8 месяцев (срок наблюдения), а также снятие напряженной эпизоотической ситуации.
В отношении оценки поствакцинального иммунитета существуют различные мнения. Одни считают, что оценка напряженности поствакцинального иммунитета при респираторных вирусных инфекциях по уровню сывороточных AT не полностью отражает иммунологический статус организма, так как важную защитную роль при этих болезнях играют местные секреторные AT. По мнению других, оценку иммуногенной активности парагриппозных вакцин необходимо проводить по результатам экспериментального заражения и продолжительности выделения вирулентного вируса. Поствакцинальные ВНА и анти-ГА, имеющие наибольшее значение, появляются в сыворотках крови на 8—14 сутки после прививки, достигают пика к 16—28-му дню и сохраняются в течение 4—6 месяцев. При изучении динамики поствакцинальных AT в носовых секретах местные секреторные AT выявлялись с 5—6-го дня (1:8— 1:16), достигали максимума на 9-й день (1:64 — 1:128) и в последующем снижались. При этом сывороточные AT регистрировались в более поздние сроки. Уровень их коррелировал с секреторными AT
Телята получают материнские AT в зависимости от уровня AT в организме матери. У коров титр молозивных анти-ГА в день отела составлял 1:640 — 1:5120, а в сыворотке крови—до 1:60— 1:1280. Период полураспада молозивных AT потомства — 3—14 дней (в зависимости от класса глобулинов), но при достаточно высоком начальном титре они могут сохраняться до 2—3 и даже 5 месяцев. Гуморальные и секреторные поствакцинальные AT у вакцинированных телят сохраняются от 6 месяцев до одного года. Повторное подкожное введение живой вакцины вызывало АГ-ответ с максимальным пиком AT на 14—15-й день, продолжительность их циркуляции составляла 4—4,5 месяца. При интраназальной ревакцинации AT персистировали в 1,5 раза дольше. После интраназального введения живого вируса титр секреторных AT сохранялся в течение 6—8 недель, после ревакцинации AT выявляли до 5 месяцев. Продолжительность и напряженность постинфекционного или поствакцинального иммунитета ПГ-3 обеспечиваются преимущественно IgG и секреторными AT IgA, выработка которых стимулируется инфекционным и активным вакцинальным процессом. Считают, что уровень сывороточных AT не всегда коррелирует с устойчивостью вакцинированных животных к заражению. Привитые телята с титром гуморальных AT 6,3—10,3 log2 оказались устойчивыми.
Что касается роли материнского иммунитета в резистентности животного к ПГ-3, то в этом отношении нет однозначной точки зрения. Так, заражение телят с колост-ральными AT аэрозольно вирусом ПГ-3 вело к развитию заболевания, но в несколько меньшей степени, чем у серонегативных животных, лишенных молозива. У телят с молозивными AT уровень гуморальных и секреторных AT не увеличивался. В то же время было показано, что телята с титром материнских AT 1:32 и выше были устойчивы к интраназальному заражению, тогда как титр AT 1:20 и ниже не предохранял их от болезни. Считают, что молозивные AT предохраняют в среднем менее 50 % Телят месячного возраста.
Многие авторы доказали, что интраназальная прививка сокращает продолжительность выделения вирулентного вируса. Животные, иммунозированные внутримышечно, после аэрогенного заражения вирулентным вирусом ПГ-3 выделяли вирус в течение 6—9 дней, а привитые интраназально — в среднем 0,8—1,8 дня. Выделение вируса ПГ-3 зависит от метода введения вакцины, а продолжительность выделения — от иммунного статуса животных. В защите против ПГ-3 преобладают гуморальные факторы, но также хорошо выражен и клеточный иммунитет. Наличие его регистрируют в различного рода тестах: реакции кожной гиперчувствительности, реакции стимуляции лимфоцитов и реакции ингибиции миграции лейкоцитов.