Приведені особливості використання імуногістохімічного методу діагностики вірусних хвороб продуктивної птиці. Метод полягає у візуальному виявленні антигенів збудника (білків вірусу) в гістологічних зрізах уражених органів і тканин шляхом забарвлення комплексів, до складу яких входять вірусні антигени, специфічні антитіла проти них, вторинні антитіла мічені біотином та кон’югат стрептавідину з пероксидазою хрону. Визначена динаміка і локалізація антигену у органах хворої птиці. Ділянки, в яких присутній антиген, виявляють шляхом забарвлення за допомогою вторинних антитіл мічених ферментом.
Ключові слова: імуногістохімічний метод, імунна відповідь, діагностика, вірусні хвороби птиці.
Мета і завдання досліджень: встановлення оптимальних параметрів имуногістохімічного методу з метою виявлення антигенів віруса в органах і тканинах продуктивної птиці (на прикладі інфекційної бурсальної хвороби).
Материал і методи: Дослідження проведені на базі НДЦ Біобезпеки і екологічного контролю ресурсів АПК Дніпропетровського державного аграрного університету.
Процес імуногістохімічного аналізу включає ряд послідовних етапів: відбору та фіксації матеріалу, отримання зрізів, зневоднення, демаскування антигенів, інкубації з сироватками, імунного забарвлення, дофарбовування і виготовлення гістологічних зрізів.
Для успішного проведення імуногістохімічної реакції необхідно Создать Відповідні оптимальні умови, які, з одного боку, підвищили б ефективність взаємодії антигена з антитілом, а з другого – звели б к мінімуму неспецифічне зафарбовування (фон).
Матеріал для дослідження відбирали від курчат-бройлерів 33-40 добового віку з клінічними та патоморфологічними ознаками ІБХ та здорових птиць контрольної групи відповідного віку безпосередньо після забою.
Проби для імуногістохімічних досліджень являють собою фрагменти органів (клоакальна сумка (фабріцієва бурса), нирки, селезінка, головний мозок), які відбирали від клінічно хворої або підозрілої на ІБХ птиці кількістю 7–9 голів безпосередньо після забою із дотриманням вимог МЕБ та існуючих правил біоетики.
Проби тканин повинні мати довжину, ширину і товщину не менш ніж 0,5см×0,5см×0,5см. Проби гетерогенних за структурою органів відбирають з таким розрахунком, щоб в них потрапили усі основні структурно-функціональні зони. Проби з гомогенною за структурою органів відбирають довільно, бажано з капсулою. При наявності чітко виражених патоморфологічних змін пробу відбирають на межі з нормальними тканинами та з найбільш уражених ділянок органу.
Для контролю відбирають проби з тих самих органів від 4–5 SPF курчат віком від 7 тижнів до 10 тижнів.
В якості позитивного контролю викоритовують зрізи приготовані із зразків від клінічно хворих курей, для яких наявність збудника ІБХ доведена патоморфолочічними, серологічними та імуноферментним методами.
Сироватку крові хворих циплят використовували як джерела специфічних антитіл до антигенів вірусу ІБХ.
Матеріал фіксували в 10% нейтральному забуференной формаліні. Нейтральний рН створювали за допомогою фосфатного буферу. Фіксацію проб проводили при кімнатній температурі (150 С до 200 С) впродовж 24-48 год. Критерієм завершення фіксації проби є рівномірне її ущільнення та рівномірне забарвлення на розрізі з відсутністю червоних або рожевих ділянок.
Для успішної взаємодії антигену та антитіла епітопи повинні бути легкодоступними, тобто знаходитися на поверхні молекули. При денатурації молекул (наприклад, під дією фіксуючої рідини) епітопи можуть знижувати свою імуногенність. Також на просторову структуру молекул, а значить і на імуногенність її епітопів, може впливати pH навколишнього середовища.
Після закінчення фіксації формалін з проб видаляється шляхом промивання їх в проточній воді протягом від 24 год до 48 год, в залежності від розмірів проби. Зневоднення (дегідратацію) та ущільнення зразків проводили за загальноприйнятою в гістології методикою.
Зрізи з парафінових блоків товщиною від 4 мкм до 6 мкм виготовляли за допомогою полозкового мікротому. Виготовлені зрізи переносили на предметне скло з адгезивною поверхнею Super Frost/Plus Slides (Menzel-Glaser) та витримували у термостаті при температурі 370 С протягом від 2 год до 6 год. Висушені зрізи депарафінізують у ксилолі протягом 5 хв, а потім зневоднюють в 96% етанолі 3 хв та висушують при температурі 200 С – 250 С протягом від 50 хв до 60 хв.
Виготовлені зрізи використовують зразу ж для імуногістохімічної реакції, або зберігають не більше ніж 20 діб у морозильній камері загорнутими в алюмінієву фольгу при температурі мінус 200±1,00 С.
ПОСТАНОВКА ІМУНОГІСТОХІМІЧНОЇ РЕАКЦІЇ
Антитіла розпізнають епітопи переважно в стереоструктурі, зміна якої під дією фіксаторів різко знижує антигенні властивості білків.
Фіксація тканин формаліном, хоча і в меншій мірі ніж інші фіксуючі рідини, але все ж змінює тривимірну структуру білка в досліджуваному матеріалі, що призводить до маскування антигенів. За певних умов тривимірну структуру білка можна відновити. Тому в процедуру обробки матеріалу при проведенні імуногістохімічних досліджень вводиться етап демаскування.
Демаскування антигенів проводили шляхом нагрівання в мікрохвильовій печі. В якості розчину використовували ЗФР з фіксованим рН. Використовували скляні ємності. При розміщенні стекол в мікрохвильовій печі ємності закривали, щоб обмежити витікання рідини, розчин обов'язково повинен покривати зрізи, щоб попередити пошкодження зрізів. Відстань між стеклами має бути не менше 2-4 мм - для вільного руху бульбашок повітря в рідині.
В підготовлених зрізах блокували активність ендогенної пероксидази розчином пероксиду водню у метанолі 10 хв при температурі 200 С – 240 С.
Блокування неспецифічної сорбції на зрізах проводять 3%-вим розчином сухого знежиреного молока. На кожний зріз наносять від 0,05 см3 до 0,1 см3 блокуючого розчину і витримують скельця у вологій камері протягом 60 хв при температурі 280 С – 300 С. Для створення вологої атмосфери у пластиковій камері на дно клали вологий фільтрувальний папір. Всі наступні інкубації зрізів проводили у вологій камері.
Після блокування зрізи одноразово промивали ФСБР та інкубували із специфічними до антигенів вірусу ІБХ антитілами, для чого наносили на кожний зріз від 0,05 см3 до 0,1 см3 робочого розчину антитіл. Скельця із зрізами вкладали у вологу камеру і витримували 60 хв при температурі 370±0,50 С.
Після інкубації із специфічними до антигенів вірусу ІБХ антитілами скельця із зрізами відмивали ФСБР три рази по 5 хв. Залишок розчину навколо зрізів видаляють за допомогою фільтрувального паперу.
На відмиті зрізи наносили від 0,05 см3 до 0,1 см3 робочого розчину вторинних антитіл. Інкубували зрізи протягом 60 хв при температурі 370±0,50 С.
Після інкубації із вторинними антитілами скельця із зрізами відмивали ФСБР 3 рази по 5 хв. Залишок розчину видаляли за допомогою фільтрувального паперу.
На відмиті зрізи наносили від 0,05 см3 до 0,1 см3 робочого розчину кон’югату стрептавідин–пероксидаза хрону. Інкубували зрізи з розчином кон’югату протягом 30 хв при температурі 370±0,50 С.
Після інкубації з кон’югатом стрептавідин–пероксидаза хрону скельця із зрізами відмивають ФСБР 3 рази по 5 хв. Залишок розчину видаляють за допомогою фільтрувального паперу.
Важливим етапом будь-якого імуногістохімічного методу є візуалізація результатів реакції "антиген-антитіло». Виявити антитіла, що зв'язалося з антигеном, можна використовуючи різні мітки, пов'язані з Fc-фрагментом антитіл.
Такими позначками можуть бути флюорохроми, ферменти, метали та металопротеїни, радіоізотопи, проміжні сполучні речовини (біотин, дігоксин та ін.). Дані мітки можуть бути кон'юговані як з первинними антитілами, так і з вторинними. Якщо мітка кон'юговані з первинними антитілами, то такий метод візуалізації називається прямим. Це найбільш простий метод візуалізації, однак чутливість його вкрай низька, тому що на одну молекулу шуканого антигену буде припадати одна позначка. Чутливість методу набагато підвищена при використанні непрямого методу, коли первинні антитіла не несуть на собі ніякого мітки, на відміну від вторинних, для яких первинні антитіла є антигеном.
Забарвлення ділянок на зрізах, з якими специфічно реагують антитіла, проводили при температурі 200 С – 240 С. На кожний зріз наносили від 0,05 см3 до 0,1 см3 розчину ДАБ і пероксиду водню у трис-буфері рН 7,2. Реакцію фарбування проводять від 4 хв до 6 хв.
Система детекції не містить біотину, це виключає неспецифічне зв'язування з ендогенним біотином. Система детекції надійно пов'язується з антитілами і не дає фонового забарвлення. Особливо зручна для виявлення антигенів, що містяться в невеликих кількостях.
Після реакції фарбування скельця із зрізами відмивали дистильованою водою 2 хв.
Висушені зрізи дофарбовували гематоксиліном Ерліха. На зрізи наносять 0,06 см3 – 0,1 см3 розчину гематоксиліну, витримують протягом від 3 хв до 15 хв. Потім зрізи промивають проточною водою впродовж від 3 хв до 5 хв до появи синього забарвлення. Дегидратация.
Висушені зрізи заводять в бальзам або полістирол.
Результати досліджень:
Зрізи аналізують методом світлової мікроскопії, при збільшенні ×400 разів та ×1000 разів, фотографують за допомогою цифрової камери і зберігають зображення у форматі малюнків на електронних носіях.
Негативний результат – зрізи (гістопрепарати) забарвлені гематоксиліном у світло-синій колір. Відсутність контрастного коричневого забарвлення на зрізах. Допускається незначне рівномірне коричневате забарвлення на рівні фону.
Позитивний результат – присутність на зрізах ділянок з контрасним коричневим імунозабарвленням [1, 7]. Інтенсивність імунозабарвлення прямо пропорційна кількості антигенів вірусу в межах розведення відповідних специфічних антитіл від 50 до 250 разів [4, 6].
При мікроскопії гістопрепаратів забарвлені імунні комплекси виявляють переважно у протоплазмі і частково у плазматичній мембрані клітин.
При порівнянні зрізів позитивного контролю з дослідними локалізація забарвлення має бути збіжною для відповідних органів.
Забарвлення зрізів негативного контролю має бути на рівні фону з відсутністю ділянок контрастного коричневого забарвлення.
Антиген у гістологічних препаратах органів птахів дослідної групи після імуногістохімічного фарбування мав вигляд локальних або дифузних скупчень округлої та глибчастої форми коричневого кольору. На гістологічних зрізах органів тварин контрольної групи таких скупчень не спостерігалось.
При дослідженні імуногістохімічних змін у бурсі Фабриціуса було встановлено, що антиген у вигляді дрібних глибок накопичувався в міжфолікулярній сполучній тканині.
Отже, одержані результати свідчать, що більшу кількість антигена ІБХ було виявлено в гістологічних зрізах селезінки.