Приведены особенности использования иммуногистохимического метода диагностики вирусных болезней продуктивной птицы. Метод заключается в визуальном выявлении антигенов возбудителя (белков вируса) в гистологических срезах пораженных органов и тканей путем окраски комплексов, в состав которых входят вирусные антигены, специфические антитела против них, вторичные антитела меченые биотином и конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена. Определена динамика и локализация антигена в органах больной птицы. Участки, в которых присутствует антиген, обнаруживают путем окраски с помощью вторичных антител меченых ферментом.
Ключевые слова: иммуногистохимический метод, иммунный ответ, диагностика, вирусные болезни птицы.
Цель и задачи исследований: установление оптимальных параметров иммуногистохимического метода с целью выявления антигенов вируса в органах и тканях продуктивной птицы (на примере инфекционной бурсальной болезни).
Материал и методы: Исследования проведены на базе НИЦ Биобезопасности и экологического контроля ресурсов АПК Днепропетровского государственного аграрного университета.
Процесс иммуногистохимического анализа включает ряд последовательных этапов: отбора и фиксации материала, получения срезов, обезвоживания, демаскирования антигенов, инкубации с сыворотками, иммунной окраски, докрашивания и изготовления гистологических срезов.
Для успешного проведения иммуногистохимической реакции необходимо создать соответствующие оптимальные условия, которые, с одной стороны, повысили бы эффективность взаимодействия антигена с антителом, а с другой - свели бы к минимуму неспецифическое окрашивание (фон).
Материал для исследования отбирали от цыплят-бройлеров 33-40 суточного возраста с клиническими и патоморфологическими признаками ИБХ и здоровых птиц контрольной группы соответствующего возраста непосредственно после убоя.
Пробы для иммуногистохимических исследований представляют собой фрагменты органов (клоакальная сумка (фабрициевая бурса), почки, селезенка, головной мозг), которые отбирали от клинически больной или подозрительной на ИБХ птицы количеством 7-9 голов непосредственно после забоя с соблюдением требований МЭБ и существующих правил биоэтики.
Пробы тканей должны иметь длину, ширину и толщину не менее 0,5 см×0,5 см×0,5 см×0,5 см. Пробы гетерогенных по структуре органов отбирают с таким расчетом, чтобы в них попали все основные структурно-функциональные зоны. Пробы с гомогенной по структуре органов отбирают произвольно, желательно с капсулой. При наличии четко выраженных патоморфологических изменений пробу отбирают на границе с нормальными тканями и из наиболее пораженных участков органа.
Для контроля отбирают пробы из тех же органов от 4-5 SPF цыплят в возрасте от 7 недель до 10 недель.
В качестве положительного контроля используют срезы приготовленные из образцов от клинически больных кур, для которых наличие возбудителя ИБХ доказано патоморфологическими, серологическими и иммуноферментным методами.
Сыворотку крови больных цыплят использовали как источники специфических антител к антигенам вируса ИБХ.
Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Нейтральный рН создавали с помощью фосфатного буфера. Фиксацию проб проводили при комнатной температуре (150 С до 200 С) в течение 24-48 ч. Критерием завершения фиксации пробы является равномерное ее уплотнение и равномерная окраска на разрезе с отсутствием красных или розовых участков.
Для успешного взаимодействия антигена и антитела эпитопы должны быть легкодоступными, то есть находиться на поверхности молекулы. При денатурации молекул (например, под действием фиксирующей жидкости) эпитопы могут снижать свою иммуногенность. Также на пространственную структуру молекул, а значит и на иммуногенность ее эпитопов, может влиять pH окружающей среды.
После окончания фиксации формалин из проб удаляется путем промывания их в проточной воде в течение от 24 ч до 48 ч, в зависимости от размеров пробы. Обезвоживание (дегидратацию) и уплотнение образцов проводили по общепринятой в гистологии методике.
Срезы с парафиновых блоков толщиной от 4 мкм до 6 мкм изготавливали с помощью полозкового микротома. Изготовленные срезы переносили на предметное стекло с адгезивной поверхностью Super Frost/Plus Slides (Menzel-Glaser) и выдерживали в термостате при температуре 370 С в течение от 2 ч до 6 ч. Высушенные срезы депарафинизируют в ксилоле в течение 5 мин, а затем обезвоживают в 96% этаноле 3 мин и высушивают при температуре 200 С - 250 С в течение от 50 мин до 60 мин.
Изготовленные срезы используют сразу же для иммуногистохимической реакции, или хранят не более 20 суток в морозильной камере завернутыми в алюминиевую фольгу при температуре минус 200±1,00 С.
ПОСТАНОВКА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ
Антитела распознают эпитопы преимущественно в стереоструктуре, изменение которой под действием фиксаторов резко снижает антигенные свойства белков.
Фиксация тканей формалином, хотя и в меньшей степени чем другие фиксирующие жидкости, но все же изменяет трехмерную структуру белка в исследуемом материале, что приводит к маскировке антигенов. При определенных условиях трехмерную структуру белка можно восстановить. Поэтому в процедуру обработки материала при проведении иммуногистохимических исследований вводится этап демаскирования.
Демаскирование антигенов проводили путем нагревания в микроволновой печи. В качестве раствора использовали ЗФР с фиксированным рН. Использовали стеклянные емкости. При размещении стекол в микроволновой печи емкости закрывали, чтобы ограничить вытекание жидкости, раствор обязательно должен покрывать срезы, чтобы предупредить повреждение срезов. Расстояние между стеклами должно быть не менее 2-4 мм - для свободного движения пузырьков воздуха в жидкости.
В подготовленных срезах блокировали активность эндогенной пероксидазы раствором пероксида водорода в метаноле 10 мин при температуре 200 С - 240 С.
Блокирование неспецифической сорбции на срезах проводят 3%-ным раствором сухого обезжиренного молока. На каждый срез наносят от 0,05 см3 до 0,1 см3 блокирующего раствора и выдерживают стекла во влажной камере в течение 60 мин при температуре 280 С-300 С. Для создания влажной атмосферы в пластиковой камере на дно клали влажную фильтровальную бумагу. Все последующие инкубации срезов проводили во влажной камере.
После блокировки срезы однократно промывали ФСБР и инкубировали со специфическими к антигенам вируса ИБХ антителами, для чего наносили на каждый срез от 0,05 см3 до 0,1 см3 рабочего раствора антител. Стекла со срезами вкладывали во влажную камеру и выдерживали 60 мин при температуре 370±0,50 С.
После инкубации со специфическими к антигенам вируса ИБХ антителами стекла со срезами отмывали ФСБР три раза по 5 мин. Остаток раствора вокруг срезов удаляют с помощью фильтровальной бумаги.
На отмытые срезы наносили от 0,05 см3 до 0,1 см3 рабочего раствора вторичных антител. Инкубировали срезы в течение 60 мин при температуре 370±0,50 С.
После инкубации со вторичными антителами стекла со срезами отмывали ФСБР 3 раза по 5 мин. Остаток раствора удаляли с помощью фильтровальной бумаги.
На отмытые срезы наносили от 0,05 см3 до 0,1 см3 рабочего раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена. Инкубировали срезы с раствором конъюгата в течение 30 мин при температуре 370±0,50 С.
После инкубации с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена стекла со срезами отмывают ФСБР 3 раза по 5 мин. Остаток раствора удаляют с помощью фильтровальной бумаги.
Важным этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции "антиген-антитело". Обнаружить антитело, связавшееся с антигеном, можно используя различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител.
Такими метками могут быть флюорохромы, ферменты, металлы и металлопротеины, радиоизотопы, промежуточные соединительные вещества (биотин, дигоксин и др.). Данные метки могут быть конъюгированы как с первичными антителами, так и с вторичными. Если метка конъюгирована с первичными антителами, то такой метод визуализации называется прямым. Это наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая, т.к. на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одна метка. Чувствительность метода намного повышена при использовании непрямого метода, когда первичные антитела не несут на себе никакой метки, в отличие от вторичных, для которых первичные антитела являются антигеном.
Окраску участков на срезах, с которыми специфически реагируют антитела, проводили при температуре 200 С-240 С. На каждый срез наносили от 0,05 см3 до 0,1 см3 раствора ДАБ и пероксида водорода в трис-буфере рН 7,2. Реакцию окрашивания проводят от 4 мин до 6 мин.
Система детекции не содержит биотина, это исключает неспецифическое связывание с эндогенным биотином. Система детекции надежно связывается с антителами и не дает фоновой окраски. Особенно удобна для обнаружения антигенов, содержащихся в небольших количествах.
После реакции окрашивания стекла со срезами отмывали дистиллированной водой 2 мин.
Высушенные срезы докрашивали гематоксилином Эрлиха. На срезы наносят 0,06 см3 - 0,1 см3 раствора гематоксилина, выдерживают в течение от 3 мин до 15 мин. Затем срезы промывают проточной водой в течение от 3 мин до 5 мин до появления синей окраски. Дегидратация.
Высушенные срезы заводят в бальзам или полистирол.
Результаты исследований:
Срезы анализируют методом световой микроскопии, при увеличении ×400 раз и ×1000 раз, фотографируют с помощью цифровой камеры и сохраняют изображения в формате рисунков на электронных носителях.
Отрицательный результат - срезы (гистопрепараты) окрашены гематоксилином в светло-синий цвет. Отсутствие контрастной коричневой окраски на срезах. Допускается незначительное равномерное коричневатое окрашивание на уровне фона.
Положительный результат - присутствие на срезах участков с контрастной коричневой иммуноокраской [1, 7]. Интенсивность иммуноокраски прямо пропорциональна количеству антигенов вируса в пределах разведения соответствующих специфических антител от 50 до 250 раз [4, 6].
При микроскопии гистопрепаратов окрашенные иммунные комплексы обнаруживают преимущественно в протоплазме и частично в плазматической мембране клеток.
При сравнении срезов положительного контроля с опытными локализация окраски должна совпадать для соответствующих органов.
Окраска срезов отрицательного контроля должна быть на уровне фона с отсутствием участков контрастной коричневой окраски.
Антиген в гистологических препаратах органов птиц опытной группы после иммуногистохимического окрашивания имел вид локальных или диффузных скоплений округлой и глубокой формы коричневого цвета. На гистологических срезах органов животных контрольной группы таких скоплений не наблюдалось.
При исследовании иммуногистохимических изменений в бурсе Фабрициуса было установлено, что антиген в виде мелких глыбок накапливался в межфолликулярной соединительной ткани.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что большее количество антигена ИБХ было обнаружено в гистологических срезах селезенки.