ДНК-диагностика

Молекулярно-генетические методы предназначаются для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы). В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. Это сложные методы диагностики, требуют определённых лабораторных условий и подготовки квалифицированного персонала. Молекулярно-генетические методы проводят в несколько этапов. Первый этап всех методов – получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют каплю крови, лейкоциты, культуры фибробластов, соскоб эпителия со слизистой оболочки, волосяные луковицы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов и может долго сохраняться в замороженном состоянии.

Следующим этапом молекулярно-генетических методов является накопление (амплификация) нужных фрагментов ДНК. Его обеспечивает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в invitro.

Метод амплификации (умножение числа копий определённого фрагмента ДНК) с помощью ЦПР позволяет в течение короткого времени размножить определённую последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в миллион раз.

Следующий этап молекулярно-генетической диагностики является рестрикция ДНК на фрагменты. Рестрикция ДНК (разрезание, разрывание) производится с помощью рестриктаз, относятся к группе бактериальных эндонуклеаз.

Разделение фрагментов ДНК обеспечивается методом электрофареза на агарозном или полиакриламидном геле. В процессе электрофареза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение в геле.

После обработки геля этидия бромидом, который связывается с ДНК, проводят ультрофиолетовое облучение и обнаруживают участки свечения. Существуют и другие методы окраски геля и выявления фрагментов ДНК.

Разновидности методов ДНК-диагностики.

В гуманной медицине используют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики.

При прямой диагностике обнаруживают мутации клонированного гена, когда известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК.

Используя прямые методы ДНК-диагностики обнаруживают мутации, изменяющие длину разрезанных фрагментов ДНК, которые выявляют электрофарезом на каком-то из указанных выше геле.

Если мутации известны, то их выявляют с помощью ферментов-рестриктаз, которые распознают строго определённые нуклеиновые последовательности.

Использование ферментов бактериального происхождения – рестриктаз позволяет разрезать двойную нить ДНК в определённых последовательностях из 4-8 нуклеотидов. Разрезанные участки мутантной ДНК, отличающиеся по длине от нормальных участков. Разница в размерах мутагенных и нормальных участков ДНК выявляется методом электрофареза на агарозном или полиакриламидном геле.

Для выявления точечных мутаций используют аллельспецифическую полимеразную цепную реакцию, позволяющую многократно увеличивать уникальную последовательность ДНК с последующим выявлением мутации.

Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в тех случаях, когда при наследственных заболеваниях ген не клонирован или заболевания сопровождается повреждением различных генов, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые методы.

Косвенная ДНК-диагностика в основном сводится к анализу полиморфных генетических маркеров. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах (по составу нуклеотодов, числу нуклеотидных поворотов). На основании изменчивости состава маркеровых участков ДНК дифференцируют материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни (маркер и ген близко располагаются друг к другу).

При проведении косвенных методов ДНК-диагностики исследованных болезней осуществляют те же этапы подготовительных операций, что и при осуществлении прямых методов ДНК-диагностики. Методами ДНК-диагностики широко пользуются в зоотехнической практике.

Широкий обмен генетическим материалом между разными странами через семя производителей часто приводит к распространению не только различных инфекционных заболеваний, но также и болезней, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. Поэтому осуществляется строгий генетический контроль используемого генетического материала. В странах с высокой культурой племенного дела в каталогах быков-производителей делается отметка о наличии в родословной выявленных морфологических наследственных дефектов и результатах анализа на три генетические мутации, определяемые по специфическим участкам ДНК: BLAD (Bovine Leykocyte Adhesion Deficiensy)- дефицит адгезии лейкоцитов; DUMS( Deficiensy of Uridine Monophosphat Synthase) – дефицит активности уридинофосфатсинтезы и CVM (Complex Vertebral Malformation) – комплекс аномалий позвоночника (А. Яковлев,2004) [119].

Известно, что BLAD является мутацией, проявляющейся в дефиците адгезии лейкоцитов. Такой тип мутации вызывает заболевания у крупного рогатого скота - Гранулоцитарный синдром. Клинически оно проявляется предрасположенностью к вирусным и бактериальным респираторным и желудочно-кишечным инфекциям.

В 1995 году в США рецессивными носителями мутации были признаны 15% племенных быков и 6% коров. Число носителей мутантного аллеля на Украине составляло 3,3%, в Германии – до 30%[119].

Фенотипическое проявление BLAD дефекта обусловлено точечной мутацией в кодирующей части аутосомного гена CD18. Этот ген контролирует синтез гликопротеида В-интегрина, играющего ключевую роль миграции нейтрофилов (палочкоядерные и сегментоядерные лейкоциты) к очагу воспаления.

Фенотипические мутации проявляются только у гомозиготных потомков, которые чаще гибнут в первые месяцы жизни. Оставшиеся в живых новорожденные переболевают желудочно-кишечными и легочными болезнями, трудно поддающимися лечению.

При дефиците уродинмонофосфатсинтеазы (DUMS) фенотипически мутация проявляется только у гомозиготных (клетка или организм, содержащие два одинаковых аллеля в конкретном локусе гомолитических хромосом) животных, вызывали гибель эмбрионов после первых 40 дней развития.

CVM (комплекс аномалий позвоночника) открыт в Дании. Он вызывает уродства телят и аборты у коров. Частота распространения этого дефекта в гетерозиготном состоянии достигает 20% и выше.

В настоящее время методом, позволяющим безошибочно определить носительство мутаций BLAD и DUMS в гетерозиготе, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с помощью специально подобранных праймеров.

При использовании этого метода на племпредприятии «Невское» Ленинградской области из 127 проверенных быков 6 из них (4,7%) оказались гетерозиготными носителями мутации BLAD. Среди всех быков - носителей генетического дефекта DUMS не обнаружено [119].

Для диагностики стресс-синдрома у свиней (ССС) использовался галотановый тест, молекулярно-генетический контроль стресс-чувствительности.

С развитием ДНК-технологии стало возможной идентификация генов, связанных с хозяйственно полезными признаками, делать оценку полиморфизма гена RVRI свиней.

В свиноводстве нежелательным генетическим грузом является мутация в рианадин-рецепторном гене RVR1. Была установлена положительная коррекция между селекцией свиней на мясность с высокой долей чувствительности к стрессам. В результате возникает заболевания, сопровождающееся злокачественной гипертермией и снижением естественной резистентности (ССС). Стало известным, что влияние RVR+ генотипа на признаки туши составляет от 3,5 до 27%, на критерий качества мяса – 60%.

При исследовании ядерной ДНК свиней Белорусской мясной породы, разводимой в РУСП «Заречье» Минской области найдена точковая мутация в позиции 1843 гена RVR1, представляющая собой замену нуклеотида (цитозина на тимин). Её наличие совпадает с появлением у свиней мышечного рецепторного белка с изменённой структурой (замена аминокислоты аргинина на цистин). Был выявлен полиморфизм гена RVR1, представленный двумя аллелями: N- без мутации, n – с точковой мутацией – и обнаружены генотипы NN и Nn (И. Шейко, Т. Епишко, 2005) [ 112 ].

Ученные института свиноводства Украинской аграрной академии наук [6] сообщают, что при использовании метода выявления мутации в положении 1843RVRI – гена в популяции крупной белой и миргородской пород свиней носительство мутантного гена не выявлено, тогда как в полтавской мясной породе концентрация его составляла 21,5%. Расхождение результатов диагностики стресс чувствительности животных, проведённой классическим галотановым и ДНК-тестом, находилась на уровне 8%.

В зоотехнии используют метод индексной оценки устойчивости коров к маститу, лейкозу, поражению конечностей. В расчете индексных коэффициентов используют стандартное отклонение 6,нормированное отклонение t и коэффициент наследуемости h² (А. Коровушкин,2004).[ 56 ].

В селекционно-племенной работе широко используют Метод генетических маркеров. Современные молекулярно-биологические методы позволяют по образцу ДНК, выделенной от животного, установить генотип по тому или иному локусу - области локализации определённого генетического элемента на хромосоме, и, следовательно, прогнозировать развития определённых признаков. С использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин фрагментов реакции (ПДРФ), можно выявить носительство BLAD - мутации, устанавливать генотип по генам – казеина, BOLADRB3. Методом ПЦР в пробе крови или спермы возможно выявление ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота. Анализ ДНК позволяет обнаружить животных, устойчивых к лейкозу. При завозе быков проводят тестирование с целью выявления аллелей, отрицательно влияющих на хозяйственно-полезные признаки и устойчивость к заболеваниям. (Н. Ковалюк и соавт.,2004)

Для анализа наследования животными отдельных признаков используются маркеры групп крови. Иммуногенетические маркеры могут быть использованы для выявления сцепления генов групп крови с генами, влияющими на продуктивность потомков оцениваемых быков, анализа генофонда рекордистов, совершенствования методов подбора и отбора молочного скота.

В последние годы интенсивно ведутся исследования по использованию групп крови для раннего прогнозирования продуктивности животных и выявления различных аномалий. Группы крови у животных вполне могут быть использованы в качестве объективного показателя в целях уточнения не только отдельных особей, но и целой группы; объединённых потому или иному принципу (С. Исламова, Ф. Исламов, 2006).[ 45]

Генетическое совершенствование продуктивности животных привело к распространению генетических аномалий. Под термином «генетические аномалии» понимают любое отклонение от нормы в геноме и генотипе животного, создающее угрозу для жизни, вызывающее предрасположенность к опасным заболеваниям, предопределяющих потерю способности к воспроизводству и снижению продуктивных качеств, как самого пробанда так и его потомства (Правила генетической экспертизы племенного материала крупного рогатого скота, утверждённые МСХ РФ от 19.10.2002г.).

Как указывают Н. Г. Букаров, Е. Ю. Лебедев и др. (2005)[11] в соответствии с названным документом, генетические аномалии у крупного рогатого скота выявляются осмотром и цитогенетическим ДНК-анализом. Эти авторы дают характеристику аномалий у крупного рогатого скота с обозначением следующей аббревиатуры: CVM, BLAD и DUMS.

CVM - Генетическая мутация (Complex Vertebral Malformation, сложное позвоночное уродство). Животных носителей этого гена в каталогах отмечают значком маленькими буквами - cv, а свободных от этой мутации значком больших букв – TV.

Эта мутация проявляется в случаях, когда мутагенный ген (CVM) унаследован от отца и матери. До 80% таких гомозиготных эмбрионов и плодов, рассасываются или подвергаются выкидышу. К 260 дню стельности плоды, не подвергшиеся аборту, рождаются мёртвыми, с искривлённым позвоночником, аномальными рёбрами, сердцем и другими органами.

Мутация CVM наследуется по Менделю как простой аутосомно-рецессивный признак. Например, если бык носитель CVM мутации (генотип cvTV) спаривают с коровой (тёлкой) не носителем мутагенного гена (TV \TV), то в потомстве 50% животных будут носителями CVM, а 50% не носителями. Наиболее часто встречаются CVM мутации у голштинского скота, разводимого в Голландии.

BLAD ( Bovine Leukocyte Adhesion Deficec) – мутация функциональной недостаточности лейкоцитов, сопровождаемая иммунодефицитом. В каталогах особи, обследованные на наличие BLAD - аномалии принято обозначать: TL - животное проверено и не является носителем гена BLAD . BLAD-аномалия, проявляющаяся только у гомозиготных по BLAD животных. Она характеризуется предрасположенностью животных к инфекционным и неинфекционным заболеваниям. У гетерозиготных животных (организм, имеющий два различных аллеля в конкретном локусе гомолитических хромосом) подобные фенотипические отклонения не выявлены. Мутация сопровождается снижением способности лейкоцитов обнаруживать и присоединяться к чужеродным антигенам (снижение адгезивности).

DUMS (Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase) – мутация связанная с дефицитом фермента уридинмонофосфатсинтетазы, обнаруживается в эритроцитах и тканях преимущественно голштинского скота. Такой вид мутации также сопровождается гибелью зародышей и рождением мертвого приплода. Как указывают Н. Г. Букаров и соавторы [ 11] генные мутации BLAD, CVM и DUMS необходимо контролировать преимущественно через быков. В России эти мутации определяют во Всероссийском институте животноводства (ВИЖ) и некоторых других институтах.

Методы ДНК-диагностики используют для выявления гена рецептора  E. Coli F18 (EC R F18), предопределяющего предрасположенность новорожденных поросят к колибактериозу). Как указывают О. Василюк, Л. Лобан и соавторы [ 13] наблюдается тесное сцепление гена рецептора E. Coli с геном альфа-1-фуказилтрансиферазы (FUT 1 ). В гене FUT 1 выявлен полиморфизм, причиной которого является точковая мутация A→G в позиции 307. Поросята, имеющие генотип GG и AG, предположительно считаются восприимчивыми к колибактериозу, а генотип АА – устойчивыми. Выявление данной мутации сделало возможным проведение молекулярной генной диагностики полиморфизма гена ECR 18 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод разработан в Центре Всероссийского научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ) Россельхозакадемии и начал внедряться в производство. В частности, при исследовании свиноматок плановых пород Республики Белорусь установлено, что частота встречаемости чувствительного к колибактериозу аллеля G у свиней породы крупной белой очень большая, у породы ландрас несколько меньшая. Самая высокая частота встречаемости устойчивого к колибактериозу генотипа АА наблюдалась у животных мясных пород: белорусская мясная – 16% и ландрас – 11,2%.

 Заболеваемость поросят колибактериозом у потомства свиноматок с генотипом АА оказалась в 1,98 раза ниже, чем у животных с генотипом GG, что позволяет говорить о наличии тенденции влияния генотипов гена ECRF18 / FUT1 на проявление колибактериоза у поросят. Сохранность поросят с генотипом АА была на 5,7% выше, чем с генотипом GG [13]. С целью снижения заболеваемости крупной белой породы колибактериозом и повышения их сохранности авторы рекомендуют на племпредприятиях применять ДНК - диагностику генотипов ECR 18/ FUT 1 основных хряков и свиноматок с целью последующего подбора пар с учётом генотипа по данному гену.

 Мариуца А. Э., Глазко В. И. (2002)[69] указывают, что у черно-пестрых голштинов встречается генетически детерминированные заболевания, проявляющиеся уменьшением адгезивности лейкоцитов (BLAD). При этом процессе распространения мутации BLAD продолжается. По данным этих авторов в некоторых хозяйствах Херсонской области частота встречаемости таких животных достигла 14%, а в отдельных хозяйствах Киевской области – 17%.

 В табунном коневодстве, при содержании конематок в косяках становится невозможным проведение точных записей происхождения жеребят по отцу. Поэтому для ведения углублённой селекционной работы с лошадьми продуктивного направления используют иммуногенетический метод контроля происхождения жеребят по группам крови и полиморфизму белков сыворотки крови. Использование иммуногенетических маркеров по группам крови, типам трансферинов, альбуминов и эстразе позволяет устанавливать происхождение всех исследуемых жеребят [91].

 В овцеводстве в качестве дополнительного селекционного признака используют живую массу ягнят при рождении. Ягнята с живой массой при рождении 3,5-3,9кг отстают от более крупных сверстников (6,5кг и более) в возрасте 1 года на - 9,2кг (16,6%), в возрасте 2 лет - на 5,5кг (9,9%), в возрасте 3 лет – на 6,0кг (10%). Наиболее высокий настриг шерсти (6,3кг) был у ярок, имеющих максимальную массу тела при рождении 6,5кг и выше (С. А. Ерохин,2006)[35].Автор делает заключение о том, что показатель живой массы при рождении можно использовать в качестве дополнительного селекционного признака.

 В целях снижения заболеваемости животных внутренними болезнями, хирургической и генетической аномалией крупного рогатого скота возникает необходимость при подборе быков-производителей иметь четкую информацию о степени предрасположенности животных линий или родословных групп к болезням и в зависимости от частоты заболеваемости исключать или ограничивать дальнейшее их использования (А. В. Емельянов,1990)[34]. Автор указывает на то, что наиболее часто по наследству передаются спастический парез задних конечностей, другие болезни конечностей.

 Установлена наследованная предрасположенность крупного рогатого скота к лейкозу. Таким образом, в борьбе с неинфекционными и инфекционными болезнями продуктивных животных важную роль отводят генетическому отбору производителей.

 Кочнев Н. Н.(2004)[57]установил наследственную предрасположенность животных к кетозу. Коэффициент наследуемости устойчивости к кетозу составляет 12%, а коэффициент повторяемости – 34%.

 Наследственно - обусловленное различия между быками-производителями установлено по выбытию телят в разные возрастные периоды. Автором выявлено влияние генофонда пород на заболеваемость конечностей. Наиболее устойчивым к заболеванию конечностей оказался местный черно-пестрый скот. Заболеваемость среди коров немецкого, датского и голштинского происхождения была значительно выше (21,1-30,4%).