[Murine leukemias]

Онкорнавирусы мышей можно разделить на две группы: лейкозные и саркоматозные. Отдельно стоит вирус Биттнера — единственный РНК-содержащий вирус, вызывающий рак.

Онкорнавирусы мышей по морфологии разделяются на вирионы типов В и С. Вирионы типа В, основным представителем которых является вирус опухоли молочных желез MTV, трансформируют клетки эктодермального происхождения (карциномы), их РНК негомологична МиЦУили MSV. Основной структурный белок вирионов типа В представлен гликопротеином с мол. м. 52кД, иммунологически белки этого типа вирионов отличны от белков вирионов типа С, нуклеоид эксцентричен. В настоящее время выделено несколько типов MTV. Одни из них передаются генетически, другие нет. По биологическому эффекту они подразделяются на трансформирующие и не-трансформирующие. Основной белок их имеет мол. м. ЗОкД; нуклеоид занимает в вирионе центральное место. Изучен полиморфизм эндогенных провирусов ВЛМ у видов диких мышей, включая Mus musculus (M. m. castaneus, M. m. molossinus и М. m. domesticus), M. spretus и М. spicelegus, а также у некоторых инбредных лабораторных штаммов. Обнаружено несколько уникальных форм организации последовательности в областях U3 длинных концевых повторов. Показано, что провирусы ксенотроп-ных ВЛМ присутствуют только у подвидов М. musculus, а провирусы политропных ВЛМ — у Mus musculus и М. spretus.

Уникальный провирус HEMV из М. spicelegus равноудален от экотропных и политропных провирусов и может быть родственным общему предку ВЛМ. Древний тип политропного провируса ВЛМ обнаружен у М. spretus. Несмотря на их филогенетическое положение «общего предка», провирусы этого типа не имеют широкого распространения у мышей, что указывает на недавнее распространение ВЛМ за счет интеграции, а не наследования. Таким образом, в недавней эволюции этих ВЛМ участвовали чередующиеся периоды репликации в качестве вируса и резиденции в зародышевой линии.

По способности репродуцироваться в гомологичных и гетерологичных клетках вирусы типа С мышей (MuLV) разделяют на четыре группы: N-тропные, способные К Репродукции в клетках мышей линии NIH; В-тропные? способные к репродукции в клетках мышей линии BALB; NB-тропные, репродуцирующиеся в клетках мышей обеих линий, и ксенотропные, способные к репликации в гетерогенных клетках (кролика, крысы). Чувствительность клеток к вирусам типа С, по-видимому, контролируется геном Fvl. У грызунов репликация амфотропных вирусов лейкоза мышей (АВЛ М) зависит от экспрессии вирусных генов под контролем энехансерных элементов (ЭЭ) длиной 75 п. н. в области U3 длинного концевого повтора LTR. В некоторых линиях клеток человека репликация АВЛМ возможна в отсутствие ЭЭ. Репликация АВЛМ-ДЕ, не имеющего ЭЭ, наблюдается в избранных линиях клеток саркомы и В-лимфомы, но идет с меньшей скоростью, чем репликация целого АВЛМ. Не обнаружено встраивание в LTR чужеродных промоторов и энехансеров. Эти данные позволили предположить существование в провирусе АВЛМ вторичного ЭЭ длиной 75 п. н.

По способности вызывать первичную реакцию в инфицированном хозяине вирусы типа С разделены на три категории: лейкемические вирусы (MuLV), вирусы, вызывающие фокусы в селезенке (SFFV), и мышиные саркоматозные вирусы (MSV). Лимфатическую лейкемию в основном индуцируют MuLV. которые способны реплицироваться в различных тканях, но не могут их трансформировать. SFFV выделены в лабораториях Френд, Раушера и Попе, легко трансформируют гемопоэтические клетки в костном мозге и селезенке. Эти вирусы высоколетальны, дефектны и реплицируются в присутствии вируса-помощника.

Вирус саркомы мышей (MSV) вызывает характерные опухоли у мышей и способен трансформировать клетки, но также дефектен. Биологический эффект проявляется только в присутствии вируса-помощника — MuLV. Клетки, трансформированные MSV, разделяются на два класса: I) непродуцирующие, не освобождающие вирусных частиц и негативные по gs-АГ клетки. Вирус из них может быть активирован суперинфекцией лейкемическим вирусом; 2) саркомо-позитивные лейкемия негативные (S+ L-) клетки, содержащие геном саркоматозного вируса, продуцирующие gs-АГ и незначительное количество вирусных частиц. В препаратах мышиных онкорнави-русов обнаружены пять АГ, различия между которыми устанавливают в двух тестах: цитотоксическом, с помощью которого определяют клеточные поверхностные АГ в инфицированных клетках (тест CSA), и тест нейтрализации (тест VEA). По тесту VEA онкорнавирусы мышей делят на две группы: Гросса и группу, подразделяющуюся на четыре типа: — тип а (вирусы Френд, Граффи, Роусон-Парр, SimLV); тип b (вирусы Молони, Абельсон); тип с (вирусы Раушер, Рич, Брейар); тип d (вирус Буффей). По тесту CSA также выделены две группы: Гросс (G) и Френд-Молони-Раушер (FMR).

В оболочке вирусов лейкемии мышей (MuLV-F), кошек (FeLV-T), саркомы кошек (FeSV-st) и эндогенном вирусе крыс (NWR-1) имеются общие АГ. Так, вирусы MuLV-F и FeLV-T содержат общие поверхностные АГ, вирус FeSV-st, продуцируемый клетками крысиной опухоли, имеет общие поверхностные АГ с эндогенным вирусом Kpbic(NWR-l).

Кроме указанных вирусов, адаптированных к клеточным системам, от мышей выделены эндогенные вирусы типа С (из первичных опухолей, спонтанных или индуцированных из нормальных неопластических клеток в культуре). Так, из клеток мышей линии BALB с помощью йод-дезуксеуредина удалось активировать два эндогенных вируса типа С: N-тропный BALB-1 и ксенотропный BALB-2. В последнее время из этих клеток удалось активировать еще один эндогенный вирус. Активированные частицы типа С содержат обратную транскриптазу. По спектру чувствительных клеток эндогенные вирусы типа С разделяются на две группы ксенотропные, инфекционные только в клетках других видов, и экотропные, среди которых имеется группа, инфекционная для мышей линии BALB. Вирус лейкоза мышей Граффи является недефектным ретровирусом, вызывающим гранулоцитарный лейкоз у мышей. В ДНК раковых клеток изучены генетические изменения в локусах, являющиеся обычными сайтами провирусной интеграции в индуцируемых вирусами лейкоза мышей миелоидных, лимфоидных и эритроидных лейкозах. Саузерн-блот-гибридизация обнаружила перестройки генов c-myc, FIi-1, Pim-1 и Spi-1/PU. l соответственно в 20, 10, 3,3 и 3,3 % Случаев.

Эндогенные вирусы типа С, как правило, вообще не обладают онкогенными потенциалами либо обладают ими в очень слабой степени. В настоящее время биологическую функцию этих вирусов сводят к тому, что они либо выполняют определенную физиологическую роль в развитии опухоли путем регулирования процессов узнавания клеток и их дифференцировки, либо обусловливают частичную резистентность клеток к суперинфекции экзогенными вирусами. Передаются вирусы типа С генетически, вертикально.

Эндогенный экотропный вирус лейкоза мышей (ВЛМ) Akv является слабо патогенным по сравнению с Т-лимфотропным ВЛМ SL3—3. Найдено, что Akv и его мутант Akvl-99, имеющий только одну копию транскрипционного энхансера (ТЭ) длиной 99 н., индуцирует с частотой, близкой к 100 %, В-клеточные лимфомы с латентным периодом 12 месяцев после инокуляции новорожденным мышам NMRI. Секве-нирование провирусных ТЭ в В-клеточных лимфомах обнаружило сохранение ТЭ, отсутствие дупликации ТЭ у Akvl-99 и вариацию числа копий ТЭ у Akv. Линия клеток плазмацитомы мышей поддерживает в 3—5 раз более высокую транскрипционную активность ТЭ Akv и Akvl-99, чем ТЭ ВЛМ SL3—3. Эти данные показали, что Akv обладает В-лимфомагенным потенциалом, не зависящим от второй копии ТЭ. Однако у одной мыши обнаружены Т-клеточные лимфомы, индуцированные Akvl-99. Из 24 изученных опухолей только эта одна содержит провирусную вставку в локусе с-тус. Этот провирус имеет дупликацию последовательности длиной 113 п. н. в ТЭ, частично перекрывающуюся с повтором 99 п. н. у Akv, а также несколько сцепленных замен нуклеотидов в этой области и за ее пределами.

Эти данные позволили предположить, что Т - или В-лимфомагенная специфичность ТЭ определяется более чем одним нуклеотидом и что в специфичность вносит вклад изменение сайтов связывания факторов транскрипции семейств AML1 и NF-1. Эндогенные и экзогенные бетаретровирусы встречаются во многих эволюционно удаленных видах. Охарактеризованы несколько ранее неизвестных групп бетаретро-вирусов в геномах мыши и крысы. Каждая группа присутствует у обоих видов, несколько групп более близки известным бетаретровирусам других организмов. Представители нескольких групп выявлены у организмов, в которых ранее бетаретровирусы не были обнаружены, например, у Microcebus murinus и Carollia perspicillata. Часть элементов мыши и крысы сохранили интактные открытые рамки считывания gag, pro, pol и/или env, что говорит о возможности их недавней ретротранспозиции. Предложена модель эволюции бетаретровирусов в геномах мышевидных грызунов в течение последних 20 млн лет. и их случайного переноса в другие виды после или в ходе расселения мышевидных хозяев по всему свету.

Мишенью действия вирусов лейкоза мышей Гросса, AKR и Молони являются Т-лимфоциты, вируса Абельсона — В-лимфоциты, вирусы Френд и Раушера — эрит-робласты, вируса Граффи — миелобласты и Т-лимфоциты. Изучено влияние дефекта по репарации ошибочно спаренных оснований на многоступенчатый процесс трансформирования пре-В-клеток вирусом лейкоза мышей Абельсона. В этой модели полностью трансформированные клетки появляются после того как первичные трансформанты проходят через продолжительный апоптозный кризис. Полная трансформация коррелирует с утратой функции опухолевого суппрессорного белка р53 и негативной модуляцией белка pl9Arf, регулирующего р53. Идентифицированы высокоинфекционные варианты ВЛМ, неспособные расщеплять предшественник env белков оболочки на зрелые поверхностный белок SU и трансмембранный белок ТМ. Замены K104D, R124D, E126D, R223A и R225D значительно уменьшают расщепление env, но не мешают включению env в вирионы, которые почти столь же инфекционны, как и ВЛМ дикого типа. Это показало, что расщепление env на поверхностный белок SU и трансмембранный белок ТМ не требуется для сборки I в вирионы. У этих мутантов замены расположены далеко от истинного сайта расщепления. Это позволяет предположить, что ошибочное сворачивание мутантных I секвестирует сайт расщепления.

Все мутанты по расщеплению env проявляют значительное ухудшение связывания с рецептором, что подтверждает fledpeicr по сворачиванию env. Замена остатка аргш подавляет также расщепление env без нарушения включения в вирионы. Однако в этом случае вирионы неинфекционны и наиболее дефектны по связыванию с рецептором. Слияние клеток экспрессирующих белок оболочки env (I) вируса лейкоза мышей Молони с мишенными клетками изучено методами флуоресцентной микроскопии и измерения электрической емкости. Экспрессия полноразмерного env длиной 632 остатка не вызывает слияния с мишенными клетками ЗТЗ и приводит к очень слабому слиянию клеток ХС6. Экспрессия вариантов env с делецией R-пептида остатков 617—633 (IA) или всего цитоплазматического домена из остатков 601—632 (1В) индуцирует слияние. Укорачивание env еще на 5 остатков (до положения 595) устраняет слияние.

Кинетика образования пор слияния при 37 °С не зависит от предварительного связывания клеток друг с другом при 4 °С. Это показало, что связывание идет гораздо быстрее, чем последующие стадии слияния. Поры слияния, образованные IA и J В, имеют одинаковый начальный размер и расширяются одинаково. Таким образом, после удаления R-пептида цитоплазматический хвост env не нужен для слияния и не влияет на образовавшиеся поры. Однако остатки 595—601 нужны для слияния. Высказано предположение, что эктодомен и трансмембранный домен env отвечают за слияние и что R-пептид косвенно регулирует слияние, влияя на конформацию этих доменов в процессе слияния. Изучена способность геномов вируса лейкоза мышей Молони (ВЛММ), удлиненных на 4,8 или 11 т. н., участвовать в одиночном цикле репликации. В целом, репликация этих геномов в 5—10 раз менее эффективна по сравнению с геномами ВЛММ нормального размера.

Удлиненные геномы завершают экспрессию РНК, Образование вирионов, упаковку РНК и ранние стадии репликации менее эффективно. Коэкспрессия коротких упаковочных РНК Не усиливает упаковку или синтез длинных векторных РНК ВЛММ. Для векторов длиной 12 и 16 т. н. большинство провирусов ВЛММ имеет полноразмерные геномы. Большинство продуктов интеграции вектора ВЛММ длиной 19,2 т. н. содержит делеции, хотя некоторые интегрированные провирусы имеют длину, вдвое большую нормальной длины генома ВЛММ. Эти данные показали, что длинные ретровирусные геномы могут упаковываться и что длина генома не ограничена очень строго на любой индивидуальной стадии репликации. Возможно длинные РНК сквозного считывания, предположительно являющиеся интермедиатами в рет-ровирусной интеграции, могут упаковываться прямо, без дальнейшего процессинга.

Экспериментальная инфекция. Политропный рекомбинантный вирус лейкоза мышей (ВЛМ) Fr98 при инокуляции в брюшину вызывает тяжелое заболевание головного мозга, в отличие от политропного ВЛМ Fr54. Различная нейровирулентность может быть связана с тем, что уровень заражения микроглии в случае Fr98 в 2 раза выше, чем в случае Fr54. Предпринята попытка повысить уровень Fr54 в головном мозге за счет изменения пути инокуляции. При внутривентрикулярной инокуляции зараженных Fr54 первичных стволовых клеток (клон С172) у мышей развивается атаксия, и они погибают через 4 недели после заражения. У этих мышей развитие болезни головного мозга коррелирует с повышением уровня вирусного антигена в мозжечке и увеличением числа зараженных клеток микроглии во всех отделах мозга по сравнению с внутрибрюшинной инокуляцией. У мышей, инокулированных клетками С172, зараженными экотропным ненейровирулентным ВЛМ Fr29, клиническая болезнь не развивается, несмотря на широкое распространение инфекции в мозге. Эти различия индукции болезни центральной нервной системы, вероятно, обусловлены различиями между Fr54 и Fr29 в области SU (gp70) гена оболочки.

Из 19 соединений, атакующих остатки цистеина в цинковом пальце нуклеокапсидный белок только альдритиол-2 проявляет антивирусную активность и вызывает задержку развития болезни Френд у мышей, вызванной вирусом лейкоза мышей. Эти данные подтверждены методом количественной конкурентной ПЦР, измеряющим уровень РНК ВЛМ в моноядерных клетках периферической крови мышей. Показано, что альдритиол-2 понижает уровень РНК ВЛМ более чем в 100 раз. Высказано предположение, что антивирусные лекарства, нацеленные на цинковый палец нуклеокап-сидного белка, могут найти клиническое применение в терапии.