[Gumboro disease of poultry (IBP), Infections bursal disease (англ.); Cumboro-Krank heit, Ansteckende Bursa — Krankheit (нем.); Bursitis Infectiosa Calinae (лат.)]
Инфекционный бурсит (ИБ), болезнь Гамборо (БГ), инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) — остро протекающая, контагиозная болезнь, поражающая чаще всего цыплят 2-15-недельного возраста, проявляется диареей, апатией, отсутствием аппетита, иногда дрожью, вторичным нефрозом, поражением фабрициевой бурсы, внутримышечными геморрагиями. Впервые болезнь зарегистрировали в 1957 г. в местечке Гамборо (США) на ряде птицеферм как контагиозную болезнь цыплят неизвестной этиологии с признаками поражения почек и фабрициевой сумки. О специфическом возбудителе болезни впервые сообщил в 1962 г. Госгроу. Он назвал эту болезнь инфекционным нефрозом птиц из-за чрезвычайно сильного поражения почек у экспериментально зараженных цыплят. Так как болезнь широко распространилась в окрестностях Гамборо, то название «болезнь Гамборо» стало ее синонимом. В дальнейшем при попытке выделения этиологического агента произошла путаница в отношении этиологии синдрома нефроза птиц. Поэтому в 1970 г. на 14-м Всемирном конгрессе по птицеводству в Испании предложено не пользоваться термином «болезнь Гамборо» в номенклатуре заболеваний птиц, а принять название «инфекционый бурсит», подразумевая под ним поражение фабрициевой сумки, и как вторичный признак — нефроз.
Болезнь зарегистрирована во всех странах мира. Данные серологического исследования показывают, что зараженность стад колеблется от 2 до 100 %. ИБ распространен преимущественно в птицеводческих хозяйствах промышленного направления. Причиной этого считают постоянный импорт птицы. Часто встречаются* острые вспышки ИББ, обусловленные циркуляцией высокопатогенных штаммов. Проблемным остается вопрос специфической профилактики болезни, включая разработку схем вакцинации птиц с использованием слабореактогенных, средних и «горячих» вакцинных штаммов и инактивированных вакцин.
Опыт показывает, что «горячие» вакцины прекращают клиническое проявление болезни, в основном, позволяют контролировать эпизоотическую ситуацию. Однако они же провоцируют в хозяйствах длительное персистирование аденовирусной инфекции, проявляющейся в виде гидроперикардитов и инклюзионного гепатита. Не решенным до конца остается вопрос оптимального применения вакцин на птице, имеющих разный уровень материнских антител, целесообразности применения инактивированных вакцин в стадах, где не было острой формы болезни. По мере накопления данных о заболевании, современных методах диагностики и профилактики возрастает необходимость доведения информации до фермеров для практического использования.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Поражаются цыплята 3—6-недельного возраста (болезнь у них протекает остро), а также цыплята моложе 3 недель, не содержащие материнских AT. Такая ранняя инфекция приводит к имму-нодепрессии и повышению чувствительности к секундарной инфекции. В крови больных птиц увеличивается уровень мочевой кислоты и даже появляются кристаллические ураты в почках. Почечная ткань дегенерирует с образованием лимфоидных скоплений. Вероятно, поражение почек связано с появлением иммунных комплексов. Фабрициева сумка и селезенка подвергаются лимфоидному некрозу. Инкубационный период болезни очень короткий. При экспериментальном заражении гистологические признаки повреждения бурсы обнаруживают уже через 24 ч, а клинические — через 2—3 дня. Болезнь длится 5—7 дней. Она может протекать подостро и латентно в зависимости от иммунного состояния поголовья. В чувствительных стадах кур она появляется внезапно, уровень заболеваемости нередко достигает 100 %.
Один из первых симптомов ИБ — диарея, сопровождающаяся выделением водянистого беловато-желтого помета. У больных цыплят наблюдают депрессию, а затем (в более поздней стадии) — сенсорные нарушения: дрожание головы, шеи и затем глубокая прострация. Заболеваемость и смертность нарастают быстро и достигают максимума на 3—4-й день болезни, далее, в течение 5—7 дней она обычно идет на убыль. Отличительные признаки болезни — внезапность и высокий уровень поражения, зубчатая кривая смертности и быстрое выздоровление. Уровень смертности со-ставляетб %, но может достигать 20—37,6 %. У цыплят-бройлеров ИБ выявляется в раннем возрасте (2—8 недель). Птицы яйценоских пород более чувствительны к заражению, чем бройлеры. При заболевании их смертность составляет 5—15 %. В Хорватии вирулентные штаммы вируса ИББ вызывают до 30 % смертности бройлеров и до 80 % цыплят яичного направления. В 10—14-дневные цыплята инфицировались вирусом.
Наибольшие экономические потери вызывает субклиническая инфекция у бройлеров моложе 4 недель. Она выражается главным образом в замедлении роста. При заболевании взрослой птицы наблюдается лишь некоторое снижение процента жизнеспособности эмбрионов. Вирус проникает через пищеварительный тракт и через 24—48 ч обнаруживается в фабрициевой сумке, где на 12—15-й день эмбриональной жизни образуются В-лимфоциты. Иммунодепрессивное действие вируса проявляется снижением уровня сывороточного комплемента и нарушением системы свертывания крови.
В последние годы заметно увеличилось число вспышек ИБ, протекающего суб-клинически. При этом раннее инфицирование приведет к угнетению иммунитета, что способствует возникновению сопутствующих инфекционных болезней. Развитие хронических респираторных болезней на фоне ИБ может приводить к появлению синдрома опухания головы. У таких птиц обнаруживают опухшие подглазничные синусы, экссудат в носовых полостях, трахее и легких. При вскрытии из пораженных тканей часто выделяют сапрофитную микрофлору, стафилококки, стрептококки, псевдомонады и др. ИБ обычно наблюдают у цыплят между 21—35 днями жизни, как правило, после вакцинации их против НБ и ИБК. Помимо того, причиной различного проявления болезни могут быть различные варианты самого вируса.
Патологоанатомические изменения при первых вспышках болезни обычно наиболее яркие. В последующих выводах подобные вспышки среди цыплят повторяются время от времени, протекая менее тяжело и часто проходят незамеченными. Трупы цыплят хорошо упитаны, однако мышцы их обезвожены и бледны, зоб пустой. В грудных мышцах, особенно с медиальной стороны бедер и крыльев, встречаются точечные и пятнистые кровоизлияния, реже — на серозных покровах органов грудобрюшной полости. При экспериментальной инфекции кровоизлияния обнаруживаются только у 1 % птиц. Печень резко увеличена, на поверхности ее видны следы от ребер. Почки набухшие, увеличены, от светло-серого до темно-коричневого цвета, с четким рисунком заполненных уратами канальцев и мочеточников. Изменения почек встречаются непостоянно, при экспериментальной инфекции их обнаруживают примерно у 5 % птиц. Кроме того, отмечают увеличение селезенки, катаральный энтерит, геморрагии слизистой оболочки железистого желудка и в миндалинах слепой кишки. Фабрициева сумка является мишенью для вируса. Макро - и микроскопические изменения в ней после заражения суточных цыплят появляются в 5-дневном возрасте. Ярко выражены и весьма закономерны поражения бурсы, которые обнаруживаются даже в случаях бессимптомной инфекции. Бурса увеличена в 3—4 раза и более. У экспериментально зараженных бройлеров выявлены неоднотипные патоморфоло-гические изменения в различные сроки после заражения. Увеличение бурсы наблюдали через 36 ч после инфекции, наибольшей величины она достигала через 48 ч, а спустя 33 дня — в 3—4 раза была меньше, чем у контрольных птиц. Серозная оболочка желтоватого цвета, с заметной полосатостью. Слизистая отечная, покрасневшая, иногда пронизана петехиями. В просвете между складками бывает заметен экссудат с хлопьями фибрина, в тяжелых случаях — кровянистая жидкость или сыроподобные фибринозные слепки.
При вскрытии у птиц находят красноватые эрозии преджелудка, гепатит с обесцвечиванием печени, нефрит без гипертрофии почек, атрофированную селезенку, пе-техии в фабрициевой бурсе, но без гипертрофии, геморрагии и петехии в грудных мышцах и часто в мышцах ног, серозный перикардит, гипертрофию бурсы. Через неделю поражения становятся иными: серофибринозный перикардит, гепатит и нефрит, псевдомембранный сальпингит. Спустя несколько дней почти у всех бройлеров находили перикардит, аэросаккулит, перигепатит, перитонит.
Патогенез. Микроскопические изменения, характерные для ИБ, находят в фабрициевой сумке больных птиц. В основном они характеризуются некрозом лимфоидных и гиперплазией ретикулоэндотелиальных клеток, активизацией и пролиферацией кортикомедуллярного эпителия, формирующего на месте фолликулов железы, подобные кишечным; утолщением межфолликулярных соединительных перегородок. Патогенез ИБ заключается в поражении лимфоидных тканей, причем в первую очередь разрушаются лимфоциты фабрициевой сумки, селезенки, цекальных желез слепых отростков и др. Он зависит от влияния иммунных комплексов циркулирующих инфицированных лимфоцитов. Наиболее чувствительны к вирусу лимфоциты, на поверхности которых фиксируются IgM. Поэтому основная мишень для вируса — подкласс В-лимфоцитов. Кровоизлияния в фабрициевой сумке, грудных и бедренных мышцах обусловлены участием комплемента. Вирус проникает через пищеварительный тракт и спустя 24—48 ч локализуется в фабрициевой сумке.
Детально изучены патоморфологические аспекты ИБ птиц. Инфицированные клетки бурсы резко отличаются от интактных. Ядра смещаются к периферии клетки, гетерохроматин конденсируется около кариолеммы, поэтому кариоплазма просветляется. Митохондрии увеличиваются до 1—1,2 мкм, крипты разрушаются, матрикс становится электронно-прозрачным. Цистерны эндоплазматической сети расширяются до 100—130 нм. Аппарат Гольджи гипертрофирован, появлялись многочисленные вакуоли диаметром 1—1,5 мкм с электронно-прозрачным или гомогенным электронно-плотным содержимым, в последнем случае связанным со стенками вакуолей рыхлым материалом в виде тяжей, а сами вакуоли чаще всего имели вытянутую, каплевидную и, реже, округлую форму. Конечной стадией формирования вирионов, по-видимому, является их агрегация в виде паракристаллических скоплений диаметром 2—3 мкм в практически полностью разрушенной клетке.
Патогенез болезни зависит от воздействия иммунных комплексов циркулирующих инфицированных лимфоцитов. Наличие гемморагических поражений в скелетных мышцах, печени и других органах обусловлено участием в этих процессах комплемента. Присутствие уратов в почках и увеличение содержания в крови мочевой кислоты свидетельствуют о поражении почек. Повышение в крови лактатдегидрогеназы и глутаматоксолаттрансминазы подтверждает поражение печени. Патоморфологические изменения бурсы патогномоничны для болезни. В цитоплазме гистиоцитов и макрофагов обнаруживали скопления вирусных частиц размером 50—70 нм. Гематологические изменения характризуются лимфопенией и эритроцитозом. За 2 дня болезни снижается общее количество лейкоцитов, на 5-й день оно возрастает и достигает максимума на 7-й день после заражения. Перед смертью цыплят содержание лейкоцитов достигало 70 %, половина из них были крупные недоразвитые клетки. Установлена связь между возрастом цыплят и нарушением свертываемости крови. Высоко чувствительными к вирусу оказались лимфоциты, несущие на поверхности IgM. Эта подгруппа В-лимфоцитов и является мишенью. Вирус проявляет иммунодепрессивный эффект, поражает преимущественно незрелые В-лимфоциты. Исследователями широко обсуждается происхождение острой формы бурсальной болезни, существование возможных резервуаров и вероятность появления в будущем новых вариантов этой болезни. Аминокислотные замены в вариабельной области белка VP2 ВИББ являются молекулярной основой антигенной вариации. Однако не удалось идентифицировать горячую точку, определяющую патогенность. Фингерпринты белка VP2 считаются общими эволюционными маркерами, а не маркерами вирулентности. Критическую роль в начале болезни и в развитии иммуносупрессии играют цитокины. Апоп-тоз и некроз лимфоидных органов определяют тяжесть болезни. Специфическую роль в острой фазе болезни играют макрофаги.
У заболевшей птицы ослаблен иммунный ответ на вакцинацию и повышена чувствительность к интеркурентным заболеваниям в т. ч. БМ, НБ, И Б и ЛТ. Сравнили иммунодепрессивное действие вируса ИББ на вакцинацию против НБ среди однодневных цыплят, инокулированных различными штаммами ВИИБ. Инокулирован-ные вакцинными штаммами ВИИБ цыплята были хорошо защищены от заражения ВНБ. Невакцинированные и инокулированные штаммами S и V ВИББ обладали пониженным ответом антител на вакцинацию ВНБ и защитным ответом на вакцинацию. Иммунодепрессивное действие ВИББ подтверждалось гистопатологическими поражениями сумки Фабрициуса, фагоцитозами и снижением бактерицидной активности.
Вирус ИБ может повышать чувствительность цыплят к кишечной палочке; оба агента вызывают развитие у цыплят сходных дегенеративных изменений в фабрици-евой бурсе и тимусе. Первичная атрофия бурсы сопровождается пролиферацией кор-тико-медулярного эпителия и образованием слизи в секреторных железах. Диарея при ИБ развивается вследствие репликации вируса в энтероцитах крипт, что ведет к нарушению функции кишечника, его секреторной деятельности и обезвоживанию организма. Развитие нефроза связывают с развитием комплекса АГ-АТ, который разрушает эндотелий извитых канальцев и почечных клубочков. В результате нарушается функция почек, что вызывает интенсивное отложение уратов. Однако поражение почек не следует считать патогномоничным признаком для И Б. Цыплята, инфицированные вирусом ИБ в суточном и 7-дневном возрасте E. coli (вирус + высоковирулен-тая E. coli), погибали в 90 % случаев при развитии тяжелой формы болезни, тогда как моноинфекция E. coli индуцировала только 40 %-ную летальность. Слабовирулентный шт. Е.соН вызывал 10 %-ную гибель. Однако при сочетанной инфекции погибало 50 % цыплят.
Морфология и химический состав. Вирионы имеют форму 20-гранника, капсид состоит из 32 капсомеров, вирион безоболочечный, 55 нм в диаметре. У вируса установлена 2-спиральная РНК (59). Обнаружено два типа частиц вируса: большие — 55—60 нм и маленькие — 18—22 нм при наличии одного поверхностного АГ. Вирус имеет два сегмента геномной РНК — А и В. Сегмент А кодирует полипротеин 110 кД, который превращается в вирусные белки VP2, VP3, VP4 и VP5. РНК вируса в градиенте сахарозы седиментирует одним пиком с коэффициентом 14S, что соответствует мол. м. 2,2-106 Д. Плавучая плотность в CsCl 1,62 г/см3, в градиенте сахарозы — 1,178 г/см3. Вирусная РНК на 95 % устойчива к действию РНК-азы А. Температура плавления ее в присутствии 1 % формальдегида в стандартном буфере составляет 95,5 °С. При электрофорезе в 7,5 % ПААГ препараты вирусной РНК Разделены на две фракции. Геном вируса ИБ представлен двумя сегментами 2-спиральной РНК с мол. м. 2,5' 105 и 2,2105 Д. Из вирионов получено 5 полипептидов: VP1 (90000), VP2 (41000), VP3 (35000), VP4 (28000) и VP5.
Белок VP3 обладает высокой иммуногенностью, он имеет эпитопы, индуцирующие синтез ВНА. Из вируса выделен один из главных структурных белков VP2b и VP2a. Конформационный эпитоп белка VP 2а/2Ь — один из главных субъединиц вируса ИБ типа I, ответственных за иммуногенность. Замена одной аминокислоты в области, кодирующей АГ структуру, ответственную за индукцию ВНА, ведет к нарушению нейтрализующих свойств.
Методом ПЦР амплифицированы вариабильные участки кДНК гена VP2 пяти штаммов вируса ИБ, определена последовательность нуклеотидов и рассчитана последовательность аминокислот, установлена тесная связь между двумя вакцинными uit. GLS и Var-r. Определена также первичная структура фрагмента области основной АГ-детерминанты структурного гена VP2, шести вариантов вакцинных штаммов и проведен их сравнительный анализ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что выбор вакцинного штамма вируса ИБ должен проводиться с учетом АГ структуры эпизоотического штамма. Целесообразно использовать вакцинный штамм, обладающий наибольшей степенью гомологии в области АГ-детерминанты с эпизоотическим штаммов вируса ИБ.
Существует корреляция между АГ-свойствами и последовательностями нуклеотидов и аминокислот области сегмента А генома вируса, кодирующего VP2. Судя по изменениям спектров флуоресценции и светорассеяния, при давлении 240 МПа и 0 °С ВИББ полностью диссоциирует на субъединицы. Такая диссоциация имеет аномальную концентрационную зависимость. Электронно-микроскопически показано, что при повышении давления при 0 °С морфология вируса изменяется. Повышение давления подавляет инфекционность ВИББ и в соответствующих условиях можно получить ВИББ с полностью подавленной биологической активностью. Инактивирован-ный вирус сохраняет иммунологические свойства и имеет высокую реактивность к нейтрализующим антителам.
Вирус резистентен к эфиру, хлороформу и изменению рН (2—11). Инактивируется при рН 12. Сохраняет активность 5 ч при 56 °С, при 60 °С 30 мин, а при 30 °С в сухом помещении 150-180 дней; в присутствии 0,5 %-ного фенола или 0,125 %-ного мерти-олята 1 ч. При воздействии 0,5 %-ного формалина инактивируется за 6 ч, препаратами йода — за 2 мин при 23 °С, 0,5 %-ньтм хлорамином — за 10 мин. Устойчив к фото-динамии и УФ-облучению, чувствителен к актиномицину Д.
Антигенная структура, вариабельность и родство. В Структуре вируса обнаружено пять белков. В структуре вириона выявлены белки VP1, VP2b (происходящий из VP2), VP2a (предшественник протеина VP2 и VP3). Протеин VP2 ответственен за индукцию ВНА и типоспецифичность, а группоспецифичность обеспечивается белком VP3. Серотип I, выделенный от цыплят и патогенный для них, насчитывает шесть подтипов. Серотип II, изолированный от индеек, не патогенен для цыплят и индюшат, однако в отдельных случаях вызывает поражение респираторного тракта и суставов у индюшек до 16-недельного возраста. АГ отличающиеся штаммы одни авторы рассматривают как штаммы серотипа I, а другие — как его подтипы, полагая, что существенные различия связаны с генетической реассортацией или точечными мутациями. Такие изоляты вируса могут появляться в результате селекции, связанной, в основном, с иммунным статусом птицы. Феномен такого рода присущ и другим вирусам с сегментированным геномом. Привлекательно предположение о том, что новые штаммы могут быть производными широко применяемых ранее живых вирус-вакцин против ИБ. МонАТ, полученные на АГ, индуцирующий образование ВНА, или его детерминанты, позволяют проводить тестирование и идентификацию вновь выделенных изолятов. С их помощью можно детально изучать эволюцию и географическое распространение вируса ИБ и различных штаммов. АГ-родство двух серотипов вируса ИБ (Си-1 от цыплят и 23/82 от индюшат) не превышало 10—30 %, поэтому перекрестный иммунитет минимальный. В 1986 г. идентифицировано уже три серотипа вируса. Вирус 1-го серотипа содержит белки VP1, VP2, VP3 и VP4, а также белок VPx, который является предшественником VP2. У вируса 2-го серотипа обнаружены белки, соответствующие VP1, VP2, VP3 и VP4. В Великобритании в подавляющем большинстве стад кур AT обнаружены одновременно к обоим серотипам. Между вирусами двух серотипов существует лишь небольшое АГ-родство.
Анализ генетической вариабельности вируса инфекционной бурсальной болезни (ВИББ) позволил создать банк данных, включающий 98 последовательностей вариабельной области гена VP2 отечественных и зарубежных полевых изолятов и вакцинных штаммов ВИББ. В соответствии с гомологией нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена VP2 штаммы этого вируса разделились на несколько групп. Максимальную степень отличий имел австралийский штамм 002—73, последовательность которого была опубликована Hudson в 1986 г. Дана характеристика в антигенном и генетическом плане трех полевых изолятов ВИББ, обозначенным как U28, 3212 и MJSS и выделенным в начале 80-х годов.
В варианте ELISA для улавливания антигена использована панель с моноклональ-ными антителами (МА). Показано антигенное родство вариантов U28 и Deleware. Наиболее близкородственным оказались штаммы 3212 и GLS. Однако изолят MJSS реагировал с МА, которые были специфичны как классическим, так и вариантным штаммам ВИББ. Нуклеотидная последовательность генома высоковирулентного, вирулентного и аттенуированного штаммов ВИББ отличалась по шести нуклеотидам, три аминокислотные замены которых были расшифрованы по амнокислотам. Высокая гомология н. п. гена ВБ1 установлена у вакцинного штамма Winterfild 2512 и Р2 (аттенуированного немецкого штамма).
Ген VP2 штамма HL 96 ВИББ, выделенного в Ханчжоу в 1996 г. и аттенуированого в клетках ФКЭ, был амплифицирован с помощью ревертазной полимеразной цепной реакции (Р-ПЦР), клонирован и секвенирован. При сравнении последовательностей гена VP2 было установлено, что указанный штамм близкородственен двум аттенуиро-ванным штаммам CU-1 и PBG-98 и двум аттенуированным китайским штаммам Harbin и С/80 1 bkf. Нуклеотидная последовательность штамма HL 96 была на 98,9 % гомологична штаммам CU-1, PBG-98 и на 98,5 % — штамму Harbin, а также на 98,6 % — штамму С/80 1 bkf.
Ревертазная ПЦР была использована для амплификации нуклеотидной последовательности генома, кодирующей вариабельную область VP2 полевых изолятов U28, 3212 и MJSS ВИББ. Филогенетический анализ расшифрованной аминокислотной последовательности показал, что изолят U28 и варианты Delaware ВИББ гомологичны на 98,3 %, а изолят 3212 и вариантный штамм GLS — на 97,1 %. Схожесть изолята MJSS с классическим штаммом 52/70 составила 97,4 %. Положительная корреляция отмечена и при характеристике изолятов ВИББ другими методами.
Вирус инфекционной бурсальной болезни (ВИББ) был идентифицирован в пробах бурсы цыплят, выращенных вне США. Для обнаружения вируса использовали ре-вертазную ПЦР, а для идентификации участка в 745 пар оснований (п. о.) гена VP2 в изолятах вируса — анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Принадлежность 81 изолята ВИББ из различных стран к соответствующей молекулярной группе была определена на основании профиля ПДРФ при использовании рестриктаз BstNl и Mbol. По наличию Sspl сайта в фрагменте из 743 п. о., полученном в Р-ПЦР можно было идентифицировать высоковирулентный фенотип.
Почти половина обнаруженных вирусов имела один и тот же профиль ПДРФ с фрагментами BstNl и Mbol. Эти изоляты вируса были отнесены в новую молекулярную группу, обозначенную как группа 6, главным представителем которой являлся вакцинный штамм RS593 ВИББ с аналогичным молекулярным профилем ПДРФ. Некоторые изоляты вируса имели профиль ПДРФ, схожий с таковым в молекулярных группах 2, 3 и 4. Но профили ПДРФ не совпали с таковыми вакцинных штаммов ВИББ. У 46 % изолятов вируса был обнаружен рестрикционный сайт Sspl, что могло свидетельствовать о принадлежности их к высоковирулентному фенотипу ВИББ. Сайт Sspl не был идентифицирован в изолятах вируса, выделенных в Центральной и Южной Африке. Сконструированы замены 5- и 3-некодирующих областей (НКО) ВИББ серотипа II на НКО из полноразмерного клона кДНК сегмента А ВИББ серотипа I. Показано, что: химеры ВИББ по сегменту А могут реплицироваться в культуре клеток; белок VP1, кодируемый сегментом В ВИББ серотипа II активен с НКО серотипов I и II; химерные ВИББ заражают чувствительных цыплят и вызывают слабое истощение клеток фабрициевой сумки. Таким образом, НКО сегмента А не отвечают за разную патогенность ВИББ серотипов I и II,
Два вирулентных штамма GBF и I, выделенные в Японии, а также штамм IQ, полученный в результате адаптации в культуре клеток штамма I, формируют группу, достаточно удаленную от всех остальных групп штаммов. Следующая группа образована вакцинными штаммами 1—65, Bursine-2 и Lukert. Классические вирулентные штаммы 52/70 и STC объединены в одну неоднородную группу с вакцинными штаммами К и 228Е. Большинство классических вакцинных штаммов формируют большую группу, в которую также входят четыре российских изолята: IBDVRF-10/95, IBDVF-11/95, IBDVF-15/95 и IBDVRF-01/96.
Антигенные варианты А, Е, GLS, выделенные в США, образуют отдельную группу. Большинство российских изолятов объединяются в группу с высоковирулентными (ВВ) штаммами, выделенными в Европе (661, 74/89А, DV86, JY86) и Японии (90—11). В отличие от американских антигенных вариантов, ВВ штаммы ВИББ были охарактеризованы с использованием панели МА, как классические штаммы серотипа I. Сравнительный анализ последовательностей вариабельной области гена VP2 позволил выявить отличия между ВВ штаммами и классическими вирулентными штаммами (52/70, STC) и показать, что они относятся к разным генетическим группам.
Не установлено четкой корреляции между разделением штаммов на группы и географическим местом выделения. Тот факт, что ВВ штаммы, выделенные в Европе и Японии, имеют последовательности, идентичные или близкие к таковым большинства российских изолятов, позволяет предположить, что они имеют общее происхождение.
Таким образом, анализ генетической вариабельности ВИББ, проведенный на основе гомологии нуклеиновых последовательностей, вариабельности области гена VP2, показал, что в связи с особенностями распространения вируса, распределение штаммов на группы не зависит от места выделения вируса. Приведенный обзор свидетельствует о развитии исследований по молекулярной эпизоотологии, в том числе особенно опасных вирусных инфекций.
У индеек установлено два серотипа вируса ИБ. К 1-му были отнесены шт. AFL, ВВ, LyN и NC, ко 2-му — МО и ОН. У них не обнаружены AT к 1-му серотипу вируса ИБ.
Два вирулентных штамма GBF и I, выделенные в Японии, а также штамм IQ, полученный в результате адаптации в культуре клеток штамма I, формируют группу, достаточно удаленную от всех остальных групп штаммов. Множество АГ вариантов вируса ИБ делится серологическими методами на несколько групп: гомология меньше 10 % — различия в серотипе, гомология 10—32 % — большой подтип, гомология 33—70 % — малый подтип, гомология 71—100 % — слабое различие или его отсутствие. Все штаммы данного вируса иммуносупрессивны. Смертность и иммуносупрессия связаны со стандартными и высоковирулентными штаммами 1-го серотипа. До 1980 г. преобладала циркуляция стандартного вируса, позже — его варианты.
Серотип I представлен двумя вариантами — VA и IM. Некроз тканей фабрициевой сумки, вызванный изолятом IM, сопровождается воспалительной реакцией, тогда как у птиц, зараженных вариантом VA, воспалительная реакция была сглаженной. Кроме того, изолят IM индуцировал более сильные изменения в тимусе по сравнению с изолятом VA. Указанные варианты вируса патогенны и не нейтрализовались полностью AT против вируса серотипа I. Следовательно, вакцинация цыплят серотипом 1 не снимает возможную иммунодепрессию и экономические потери при инфицировании серологически отличными вариантами.
Недавно в хозяйствах США был выделен новый АГ вариант вируса ИБ, который не реагировал с монАТ против ранее известных штаммов, включая вакцинные (R63 и В69), однако взаимодействовал с полиАТ Авторы рекомендовали выделенный штамм для изготовления инактивированных и живых вакцин. Изоляты, выделенные в штате Джорджия CUIAU28 и 3212, различались по АГ сайтам, биологическим свойствам, патогенности и степени поражения фабрициевой сумки. Атрофию вызывает больше изолят U28.
В России изучена АГ вариабельность шести вакцинных штаммов вируса ИБ с целью их эффективного применения: Gumboral CT, Виг 706 (Франция), Taviar IBD (Италия), Gumbophyl (Венгрия), D78 (Голландия), БГ (Россия). Структурный ген VP2 (444 нуклеотида, что соответствует 148 аминокислотам) кэпирован в состав плазмиды рИС-19. Вакцинные штаммы подразделяются на две группы, которые существенно отличаются друг от друга (8 % аминокислотных замен). Как видно из приведённых примеров, выбор вакцинного штамма вируса ИБ должен проводиться с учетом АГ структуры эпизоотического штамма.
Целесообразно использовать вакцинный штамм, обладающий наибольшей степенью гомологии в области АГ-детерминанты с эпизоотическим штаммом вируса ИБ. АГ вариабельность штаммов, изолированных в России, изучена методом прямого секвенирования. Определена нуклеотидная последовательность детерминанты структурного гена VP2. Установлено, что значительная часть изолятов образует относительно гомогенную группу (не более 1,5 % нуклеотидных и 1 % аминокислотных замен). Остальные пять изолятов имеют более существенные отличия (от 2 до 7 % нуклеотидных и от 1,2 до 5,2 % аминокислотных замен).
Методом ИФА и блотинг по Вестерну изучены антигенные вариации вируса ИББ. Использовали 27 моноклональных антител против VP2 вируса, референс-набор из 9 нейтрализующих MA и 13 поликлональных сывороток цыпленка. Изменения возникали в нейтрализуемых, реагирующих перекрестно, зависящих от конформации в эпитопах и не зависящих от конформации в эпитопах в VP2. Изменения эпитопов прямо зависели от метода, используемого для размножения вируса. Таким образом, показана важная роль различных хозяев в антигенности ВИББ.
Локализация вируса. На 3-й день после экспериментального заражения 4—4,5-не-дельных цыплят вирус в высоких концентрациях накапливается в фабрициевой сумке и селезенке, и в более низких концентрациях — в мозге и крови. Из бурсальной ткани его выделяли до 14-го дня после заражения, в ИФ — до 5—6-го, в ИД — до 3—4-го дня. У однодневных цыплят через 3 дня после введения вируса отмечена высокая концентрация его в фабрициевой сумке, печени и почках. Вирус хорошо реплицируется в макрофагах и несколько хуже — в ретикулярных клетках, гетерофилах, эпителиальных клетках. Недавно было показано, что вирус размножается в лимфоцитах. Лимфо-литические явления наблюдались через 8 ч после заражения. В цитоплазме макрофагов находили сферические и гексагональные вирусные частицы. Последние обнаруживали в цитоплазме макрофагов, лимфоцитов и ретикулярных эпителиальных клетках единичными или множественными пластами.
При экспериментальном заражении вирус удавалось выделять в течение 10 дней, однако патологические изменения в фабрициевой сумке сохранялись до 10 недель после заражения. Это указывает на малую вероятность носительства вируса ИБ, кратковременность его нахождения в крови и возможность длительного обнаружения поражений фабрициевой сумки. У 4-недельных цыплят, зараженных ВИББ, выявлено истощение фабрициевой сумки лимфоидными комплексами, сопровождаемое в дальнейшем некротическими апоптозными процессами. Взаимодействие ВИББ С лимфоидными клетками изучали в срезах тканей фабрициевой сумки, заключенных в парафин от инфицированных цыплят. Для этого использовали вирусспецифичес-кий зонд, меченный диоксигеном в сочетании с иммуногистохимическим методом (ИГХМ), реакцией гибридизации (РГ) in situ и реакцией in situ Tunel (PT) с включением двойной метки. По показателям специфичности и чувствительности РГ и ИГХМ оказались равноценны.
При помощи двойной метки было показано наличие вирусного антигена в большинстве апоптозных клеток. Это свидетельствовало о прямом включении ВИББ в индуцирование апоптозного процесса. Однако в некоторых других клетках также обнаруживали либо вирусные антигены, либо фрагментированную клеточную ДНК, особенно на ранних стадиях инфекции. Это необходимо учитывать, так как апоптозный процесс, индуцированный ВИББ может распространяться далее посредством непрямого межклеточного взаимодействия. Кроме того, отмечено, что через 2 дня после инфицирования в ядрышках фолликулярных клеток бурсы выявляется вирусная РНК с помощью РГ in situ. Апоптозный процесс можно зарегистрировать в более ранюю стадию инфекции ВИББ, по сравнению с временем выявления вирусных антигенов и РНК.
Антигенная активность. Через 3 недели после заражения 3—6-недельных цыплят вирусом в сыворотках крови обнаруживают ВНА (достигают титра 1:718) и ПА. К 14-му дню титр ПА достигал 1:128, и цыплята приобретали устойчивость к заражению патогенным вирусом. AT у кур-несушек передаются потомству трансовариально. ПА в сыворотке крови появляются у птиц на 7-й, в фабрициевой сумке — на 12-й, в селезенке — на 15-й день после заражения. ВНА в индюшиных хозяйствах Германии устанавливали сразу после вылупления птенцов. Количество положительных сывороток к серотипу I варьировало от 65 до 80 %, в других же хозяйствах количество положительных сывороток к серотипу II достигало 75—100 % (67). Экспериментальная инфекция. Воспроизводится на 20—30-дневных цыплятах при инокуляции им вируссодержащего материала на слизистую оболочку глаз, в фабри-циеву сумку или per os. Первые признаки болезни проявляются тремором головы и тела, а через 48 ч — диареей. На 3-й день фекалии становятся беловатыми и содержат слизь, но к 7-му дню болезни приобретают нормальный вид. На 3—4-й день после заражения у цыплят отмечали увеличение фабрициевой сумки в 1,5—2 раза и отек. Бурса мягкая, бугристая, содержала вязкий слизистый материал, внутренние складки воспалены и желтого цвета. На 22—23-и сутки после заражения фабрициева сумка обычно уменьшается, консистенция ее становится плотной и на разрезе гладкой, слизь отсутствует. В эпителиальных и ретикулярных клетках пораженных фолликулов обычно обнаруживались ацидофильные включения, окруженные светлым ареалом. Некротические участки фолликулов обильно заселены макрофагами. У части отмечались псевдокисты. Через 3—5 дней после заражения патологические изменения фабрициевой сумки были настолько выраженными, что болезнь диагностировалась без затруднения.
На 33-, 51- и 71-й дни после заражения можно наблюдать атрофию бурсы. У 1—3-су-точных белых мышей при интраперитонеальном и интрацеребральном их заражениях (iriT. Becht) отмечали зуд, атаксию, дрожь, кому и негнойные лимфоцитарные воспаления мозговой ткани, сопровождавшиеся некрозом, демиелинизацией и скоплением лейкоцитов вокруг кровеносных сосудов. Крысы и хомяки также оказались чувствительными к интрацеребральному заражению. Индейки клинически не реагировали, но образовывали ПА и ВНА. Голуби, утки, гуси и перепела к экспериментальному заражению оказались резистентны (23). После интрабурсального заражения здоровых цыплят вирусный АГ в тканях фабрициевой сумки появлялся в 100 % случаев через 12—14 ч и обнаруживался с помощью МФА и РДП. Утки чувствительны к вирусу ИБ серотипов I и II, но не проявляют клинических симптомов болезни, между тем серотип II широко распространен в природе.
Патогенность вируса для утят сравнительно низкая, и переболевание сопровождается анорексией с небольшим подъемом температуры в течение 4—5 дней после заражения. Два вирулентных штамма ВИББ (HeB-lF и HeB-bd) оказались высоковирулентными для цыплят SPF. Через 37 ч после инокуляции 100 % цыплят были инфицированными, а смертность составляла более 50 %. У инокулированных цыплят наблюдались типичные патологические признаки. У 5-недельных цыплят шести пород после заражения вирусом ИББ учитывали смертность, относительную массу фабрициевой сумки и селезенки, степень поражения ФС, титры антител и реакцию лимфоцитов крови на митогены.
Цыплята пород Gimmizah и Fayoumi были наиболее чувствительны к инфекции (85 и 47 % соответственно). У цыплят породы Mandrach смертность составляла только 11 %, пород Leghorn, Golden, Balady — 20, 31, 37 %. В группе вакцинированных и зараженных через 10 дней смертность цыплят пород F, G,B составляла 3 %, среди цыплят пород М, Gl, L падежа не было. Чувствительность и устойчивость цыплят разных пород не коррелировала с патологическими и иммунологическими проявлениями. На основании полученных данных делается заключение, что врожденные неим-муногенные факторы могут играть важную роль в устойчивости к вирусу.
Культивирование. Вирус можно культивировать в КЭ, свободных от материнских AT, к ряду вирусных болезней, в том числе и к ИБ. Помимо эмбрионов, вирус удается культивировать и на SPF-цыплятах. У инфицированных эмбрионов вирус накапливается В Желточном мешке и в меньшей степени — в аллантоисной жидкости. Гибель КЭ наступает на 3—8-й день после заражения. У погибших отмечали отечность брюшной полости, кровоизлияния и некрозы на теле, некроз и кровоизлияния в печени, почках, гиперемию легких. На ХАО видимых поражений не развивается, лишь иногда обнаруживают небольшие кровоизлияния. Отмечены «бледное сердце», гиперемия и некроз почек, гиперемия легких.
Японские штаммы вируса размножаются в утиных эмбрионах (лучше при заражении на ХАО, чем в желточный мешок) и в культуре утиных фибробластов, но не в культуре клеток почки. Вирус хорошо репродуцируется в культуре почечных клеток КЭ, вызывая на 3—5-й день заражения ЦПД. Данная культура пригодна для титрования вируса, последовательные пассажи в ней не ведут к аттенуации вируса в отношении цыплят. В культуре фибробластов КЭ вирус образует бляшки. В-клетки высокочувствительны к вирусу, а Т-клетки — нечувствительны. Установлено, что для выращивания вакцинного штамма БГ на перевиваемых культурах клеток необходимо предварительное пассирование его в КЭ или ККФ для D-78 — 1—2 пассажа, для Гум-бофил — 2—3 пассажа. После этого (при инфекционной активности 104-75—10 5>5 ТЦД 50/мл) вакцинный вирус при оптимальных условиях в клетках Vero, RK-13, ВНК-21 репродуцировался в титрах 105,5-106,0 ТЦД 50/мл, а в клетках CV-1 и CG-91 — 10 4,75—10 5,5, в отличие от вакцинного вирулентный вирус накапливался в более высоких титрах.
При инокуляции в аллантоисную полость вирус через 4 дня накапливается в титре 105 ЭИД50/МЛ, а в культуре клеток утиных эмбрионов — 105 ТЦД 50/мл - В культуре клеток почек уток вирус не размножается. Показана возможность культивирования, типирования вируса ИБ и проведения РН в перевиваемой культуре клеток LSCE-BK3, МА-104, Vero, BGM-70. Вирус ИБ более интенсивно размножается в линии промоно-цитов IN24, чем в клетках линии ZSCC-NPJ (получена из клеток фабрициевой сумки курицы с лимфоидным лейкозом). Вирус ИБ индеек адаптирован к первичной культуре фибробластов КЭ. На 5-й день клеточный монослой зараженной культуры полностью отделялся от стенок флаконов. Титр вируса на 3-й день достигал
10 6.3 ТЦД 5о/мл.
Индюшиный шт. М-72 активно размножался в первичной культуре фибробластов и почек КЭ, а также перевиваемых линиях BGM-70 и Vero с образованием характерного для вируса ИБ ЦПЭ. ЦПЭ обычно проявлялся на 3-й день после инфицирования в виде грануляции клеток. При этом круглые и увеличенные в размере клетки располагались в монослое одиночно и в виде скоплений клеток (гроздей). Титр выделенного штамма в культуре клеток составлял на 4-й день после заражения 10 6.з ТЦД 5о/о,2 мл. Описано образование бляшек (шт. IPV) после 60 пассажей в ФЭК. Титрование вируса в ФЭК — более чувствительный метод, чем в организме новорожденных мышей. Телец-включений не находили. Вирус в культуре клеток КЭ формирует крупно - (диаметр 5 мм) и мелкобляшечные (диаметр 1 мм) клоны. Крупнобляшеч-ные клоны обладали большей патогенностью, чем мелкобляшечные. Клетки Vero чувствительны к вирусу БГ. Титр его в культуральной среде достигал высокого уровня.
Гемагглютинирующие свойства не установлены.
Различия в патогенности штаммов. Все классические вирусы ИБ, выделенные до 1985 г., имели сайт В 69, в то время как в вирионах (De Lavare, A, D, G и Е), выделенных в 1985 г., он отсутствовал. Для штаммов вируса ИБ характерна как высокая, так и умеренная патогенность. Они могут быть и апатогенными. Высоковирулентные штаммы ИБ вызывают острую форму заболевания с летальностью 30 % и более. Слабовирулентные (умеренные) штаммы индуцируют инфекцию со стертыми клиническими и патологоанатомическими признаками при летальности в среднем до 5 %. Апатогенные штаммы индуцируют субклиническое течение заболевания, точнее инаппарантную форму болезни, характерную для ряда вирусвакцин, применяемых против И Б. Следовательно, при внедрении слабовирулентных и апатогенных штаммов может формироваться постинфекционный иммунитет, как при применении вакцин Bursin+, Bursin-2, 228E и D-78.
О выделении природно-ослабленного вируса И Б впервые сообщили канадские исследователи. В 1990 г. в Японии имела место среди кур эпизоотия ИБ с высокой летальностью. Изучено 29 штаммов вируса в РДП с использованием сыворотки к штамму вируса и АГ, приготовленных из тканей фабрициевой сумки инфицированных 5—6-недельных цыплят. Удалось объединить изоляты в три группы. 1-я группа состояла из 16 штаммов, включая F539. К той же группе относился высокопатогенный шт. DV86, изолированный в 1986 г. в Голландии. Два штамма (группа 2) отличались как от F539, так и от G691. В 3-ю группу вошел G691 и 10 близких ему штаммов; они были изолированы до 1984 г. и обладали низкой патогенностью. Известны два типа штаммов (ТС и BU) вируса ИББ (ВИББ) серотипа I, которые заражают В-лимфоци-ты в сумке Фабрициуса молодых цыплят. Методом обратной транскрипции сконструированы рекомбинанты ВИББ с химерным и сегментным А из ВИББ-ТСи ВИББ-BU. Показано, что за различия фенотипов отвечает область С белка VP2. Сайт-направленный мутогенез идентифицировал одиночные аминокислотные остатки, ответственные за изменение специфичности. Однако соответствующие аминокислотные замены являются штаммоспецифичными.
Проведена оценка in vitro патогенности изолятов ВИББ, полученных от естественно инфицированных птиц, при использовании органной культуры бурсальной сумки. Лимфлобластоидную пролиферацию отмечали через 24 ч после заражения культуры с максимальным проявлением к 72 ч. Микроскопические изменения характеризовались так же увеличением количества макрофагов и образованием плазматических клеток. Антиген ВИББ обнаруживали через 24 ч методом коагглютинации. По уровню вызываемых поражений из трех изолятов ВИББ (А, В и С) изолят В охарактеризован как вирулентный, а изоляты А и С — средневирулентные. Подобные показатели патогенности указанных изолятов были отмечены и in vivo на цыплятах при определении соотношения массы тела птицы к массе бурсы и при регистрации гистологических поражений. Таким образом, бурсальная органная культура может быть использована как экспериментальная модель для дифференциации изолятов ВИББ по признаку вирулентности.
Поданным Zierenberg etal. 11 африканских и 2 германских изолятов ВИББ, выделенных во время полевых вспышек среди вакцинированных и не вакцинированных цыплят, проявляют признаки очень вирулентных штаммов. Секвенирование вариабельной области VP2 и филогенетический анализ подтвердили, что эти штаммы группируются с очень вирулентными штаммами ВИББ, появившимися в то же время в Африке, Азии и Европе. Штамм Cu-Iwt, ответственный за тяжелые вспышки инфекции в Германии 13 годами ранее, отчасти родственен этим штаммам, но имеет значительные различия на генетическом уровне, хотя и относится к очень вирулентным штаммам ВИББ.
У SPF-цыплят, предварительно вакцинированных живой вакциной, выделено четыре изолята вируса (A, D, G и Е). Изоляты отличались от классических штаммов тем, что очень быстро вызывали атрофию бурсы с минимальной воспалительной реакцией, незначительную смертность эмбрионов, но индуцируя у них некроз печени. Сравнение вирулентности полевых штаммов YBDV проводилось на цыплятах SPF. Между штаммами существовали большие различия в патогенности. Штамм GX8/99 вызывал 70—90 % смертности и рассматривался как типичный, весьма вирулентный штамм, в то время как штамм YN2/99 не вызывал смертности. Большая часть других штаммов давала 20—60 % смертности и их вирулентность находилась между стандартным вирулентным штаммом и очень вирулентным штаммом YBDV.
Проведенный анализ антигенных и генетических характеристик 17 африканских штаммов (5 марокканских, 5 тунисских, 2 алжирских, 2 египетских, 3 кенийских, 1 танзанийского) вируса, ответственных за гипервирулентиость болезни Гамборо, показал, что они сходны со штаммами wIBDV, которые присутствуют в Европе и Азии. С помощью полученных для африканских изолятов моноклональных антител (мАТ) было выявлено, что два известных штамма, один классический Faragher 52/70 хорошо взаимодействует со всеми мАТ и другой, гипервирулентный штамм wIBDV 89/63 — со всеми мАТ, кроме мАТЗ и мАТ4.
Штаммы, изолированные в Африке, согласно данным по секвенированию нук-леотидных последовательностей, были сравнимы с wIBDV 89/63. Информация, полученная по результатам лечения инфекций, вызванных африканскими штаммами, подтвердила их антигенное и генетическое родство с гипервирулентным штаммом. В связи с этим, для иммунизации против африканских штаммов вируса предлагается уже известная вакцина ILUS Winterficld 2512 G61. Проведено пассирование пяти выделенных от бройлеров штаммов ВИББ на СПФ-куринных эмбрионах (24—25 пассажей), с последующим изучением их нуклеотидных последовательностей в ревертазной ПЦР. Для суждения о генетической стабильности авторы сравнивали каждый изолят до и после пассирования на куриных эмбрионах. При использовании рестриктаз Bst NI и Mbol не наблюдали различия у изолятов в отношении полиморфизма и длины рестрикционных фрагментов. В результате выявлено шесть нуклеотидных изменений, которые были обнаружены у пяти аминокислот. Конвергентная природа шифта у трех из четырех пассированных штаммов свидетельствовало о наличии функциональной, а не случайной мутации. Выделенные из бурсы штаммы при экспериментальной инфекции вызывали типичные для ИББ признаки болезни у 3-месячных СПФ-цыплят. Следовательно, как считают авторы, аминокислотные мутации у данного вируса не влияли на вирулентность их для птицы.
Изучена возможность использования обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для дифференциации штаммов вируса инфекционной болезни бурсы (IBDV). С этой целью проанализировали два коммерческих вакцинных штамма и два хорватских полевых изолята. Амплифицировали вариабельную часть гена VP2 (422 п. н.), кодирующего главный нейтрализующий эпигон. Амплифи-цированные фрагменты охарактеризовали с помощью ПДРФ с рестриктазами Sad и Taql. ПДРФ-спектр полевых изолятов был сходным со спектром вирулентных европейских и азиатских штаммов. Профили вакцинных штаммов отличались от профилей полевых изолятов и были сходными с умеренно вирулентными штаммами phg-98 и VMG-91 и с другими классическими вакцинными штаммами с промежуточной па-тогенностью. Секвестрование гипервариабельной области белка VP2 изолятов ВИББ, выделенных от невакцинированных кур в Индонезии, показало, что большинство штаммов являются высоковирулентными штаммами. Аминокислотная последовательность VP2 четырех изолятов была идентичной в азиатских и европейских вирулентных штаммах ВИББ, в том числе, но специфичным для вирулентных штаммов остаткам 222(А1а), 256(Ие) и 294(Пе). Восемь изолятов отличались аминокислотой в положении 222 (Ala-Ser), однако эта замена не влияла на патогенность или антигенность штамма. Штаммы с заменой He272Thr и Asp289Asn не вызывают симптомов болезни и гибель птиц, они считаются природными аттенуированными мутантами ВИББ.
Интерфероногенные свойства. При заражении КЭ изолятом 2512 вируса И Б наиболее высокая его концентрация через 26 ч была обнаружена непосредственно в эмбрионе, а минимальная — в аллантоисной жидкости. Начало образования интерферона отмечено через 48 ч после инокуляции, но в эмбрионе и ХАО титр его достигал максимума через 72 ч, а в аллантоисной жидкости — через 120 ч.
Изучено онколитическое действие вируса инфекционной бурсальной болезни (ВИББ) на асцитную опухоль Эрлиха с «традиционными» липосомами, содержащими холестерин, лецитин и стеариламин с катионным липидом и ДДА-хлоридом. Средние сроки выживания мышей вирус увеличивал с 19,6 дней в контроле до 40,8 дней, сочетание ВИББ с липосомами —до 60,1 дня, с ДДА-хлоридом — до 55,0 дней, а в сочетании липосом с ДДА-хлоридом — до 59,2 дней.
ИБ болеют цыплята всех пород с 2—15-недельного возраста. Наиболее восприимчивы 3-6-недельные цыплята породы белый леггорн. Сообщалось о самых ранних вспышках ИБ среди цыплят 11-дневного возраста и самых поздних — в возрасте 84 дней. Заражение происходит при контакте здоровых цыплят с больными и через инфицированные корма, воду, инвентарь. Возможна передача вируса через яйцо и аэро-генно. Причиной поддержания инфекции в хозяйстве служит длительное (до 120 дней) выживание вируса в помещении. Инфицирование цыплят в раннем возрасте увеличивает процент заболеваемости и способствует более длительному периоду ви-русовыделения после заражения. Наличие этого вируса в организме цыплят снижает иммунологический ответ на введение вакцинного вируса НБ.
Вспышки ИББ, вызванные ВВ штаммами ВИББ, впервые были зарегистрированы в Голландии и Бельгии в 1986 г., а в дальнейшем было отмечено быстрое распространение ВВ штаммов ВИББ, которые были выявлены в Великобритании в 1988—1989 гг., в Японии в 1991 г. Кроме европейских стран, вспышки ИББ, характеризующиеся высоким уровнем смертности, были зарегистрированы в течение 1989—1993 гг. на Ближнем Востоке, в Северной и Южной Африке, Китае, Индии. В 1991 г. впервые в Молдавии, на Украине и в России были зарегистрированы вспышки ИББ, характеризующиеся острым течением болезни и высоким уровнем смертности. Как предполагают авторы, вполне вероятно, что появлению ВВ штаммов ВИББ на территории России и стран СНГ могла способствовать система комплектования племенных птицеводческих хозяйств молодняком, закупленным у зарубежных фирм, получившее в последние годы широкое распространение.
Спектр патогенности в естественных условиях. Куры всех пород — единственный вид, который поражается вирусом ИБ в естественных условиях. По-видимому, вследствие высокого тропизма вируса к слизистой оболочке фабрициевой сумки, экспериментальное заражение птицы удается в период функционирования этого органа. При заражении взрослых кур-несушек, а также 1—14-дневных цыплят не отмечено симптомов болезни. В 12 штатах США вирус изолирован от 6-недельных индюшат и индеек, у которых была отмечена диарея; вирус оказался родственным референтному шт. ТВ89. Помимо кур и индюков, вирус также выделен от летучих мышей и москитов. В последние годы его стали выделять и от уток. Впервые в нашей стране вирус выделен из гомогената фабрициевых сумок индюшат 24—37-суточного возраста и идентифицирован как вирус ИБ индеек серотипа II (шт. М-92).
Обнаружены антитела к вирусу БГ (ВБГ) у гаг (Sjmateria mollissima) и неполовозрелых серебристых чаек (Lerus Acgentatus) в Балтийском море, а также в крови очковых гаг (Somateria fischeri), гнездящихся в отдаленном ареале Западной Аляски. Титры антител около 1:16 обнаружены у 75 % гаги 45 % цыплят серебристых чаек. Дикие птицы не контактировали с домашней птицей.
Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции — больная птица. Возбудитель передается с кормами, водой, инвентарем, через яйцо, аэрогенно и другими способами. Гельминтов и вшей считают прямыми векторами передачи. Дикие птицы могут быть прямыми и непрямыми векторами.
Иммунитет и специфическая профилактика. Применение Живых Вакцин. Выявление AT без выделения инфекционного агента не может служить основанием для вынужденной вакцинации. Прежде всего необходимо идентифицировать серопринадлеж-ность вируса, определить вирулентность и подтип. Серотип II, индуцирующий ПА, а также AT, выявляемые с помощью ТФ ИФА, не вызывает патологии. Кроме того, следует уточнить, какой уровень AT и процент их циркуляции в стаде являются показанием для вынужденной вакцинации. По данным зарубежных исследователей, надежный уровень защиты обеспечивают титр ВНА не ниже 2,0 lg, ПА 1:8 и выше, AT, выявляемых ТФ ИФА, — не ниже 1:8000. В связи с этим, следует определиться с диагностическим титром в зависимости от серологической реакции, применяемой для детекции AT, и уровня сероконверсии при исследовании парных сывороток.
При проведении мер специфической профилактики необходимо учитывать факторы, отрицательно влияющие на формирование стойкого иммунитета у птицы, включая АГ-различия вируса ИБ. Это прежде всего тип АГ, способ и частота (схема) его применения в процессе вакцинации, степень аттенуации или инактивации. Известно, что живой АГ индуцирует как системный, так и локальный (в местах наиболее вероятного проникновения возбудителя), а инактивированный АГ — только системный (гуморальный) иммунитет. Отрицательно сказывается на иммунной системе высокая плотность посадки птицы, несбалансированное кормление, нарушение технологических приемов, санитарного режима и, особенно, инфицированность стада различными возбудителями, токсины и т. д. Полноценное питание обеспечивает высокую естественную резистентность, а витамины A, D3, E и Zn действуют как адъюван-ты, способствующие выработке полноценного и напряженного иммунитета.
Схемы иммунизации против ИБ не могут быть одинаковыми для разных хозяйств, необходим глубокий и всесторонний анализ с выявлением соответствия (АГ-родства) применяемых вакцин с циркулирующим среди птиц эпизоотическим штаммам ИБ. По наблюдениям ряда исследователей, общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают полного оздоровления хозяйств от ИБ. Поэтому в комплексе мероприятий по профилактике и ликвидации инфекции основное внимание уделяется специфической профилактике — вакцинации, которая должна проводиться с учетом материнских AT Так, установлена высокая степень корреляции (г) между содержанием AT в сыворотке крови несушек и желтках: для вируса ИБ — 0,84, вируса ИБК — 0,84, для реовируса — 0,91. Определение AT в желтке яиц при мониторинге бройлерных промышленных стаде помощью ELISA вполне выполнимо и рекомендовано для широкого использования. Цыплята, имеющие материнские AT в 1-суточном возрасте, обычно защищены от появления клинических признаков болезни на протяжении первых 30 дней жизни. Дифференциация полевых изолятов (шт. U-28 и 3212), отнесенных к серотипу I, показала, что АГ-родство между ними составило всего 35 %. Эти изоляты вызывали частичную атрофию бурсы без клинического проявления болезни и гибели птиц, но снижали их мясную продуктивность. АГ-родство указанных изолятов с референс штаммами было изучено в РН.
АГ-родство шт. U-28 и 3212 со шт. A (Delmarve), В (Alabama), LU, D-78 не превышало 17,7 %, а со шт. МО — 2,2 %, тогда как между шт. А и В оно было равно 100 %. У вируса серотипа II АГ-родство с другими штаммами было еще меньше. Поэтому один из основных факторов эффективности специфической профилактики — соответствие циркулирующих эпизоотических штаммов и рекомендуемых вакцин против ИБ.
Разработанные в 70-е годы прошлого столетия первые вакцины из аттенуирован-ных полевых изолятов часто не давали положительного результата и могли вызывать клиническую форму ИБ. Усовершенствованные в последствии, так называемые «умеренные» вакцины не могли преодолевать пассивный иммунитет, а у интактных цыплят вызывали иммуносупрессию и клиническую форму болезни. Полученные затем аттенуированные вакцины из клонированного шт. PGB-98 (Baxenedal) и шт. D-78 успешно использовали для профилактики ИБ, но и они не преодолевали высокий уровень трансовариальных AT и, следовательно, не создавали надежной защиты. Поэтому усилия ученых были направлены на создание живых вакцин, способных преодолевать пассивный иммунитет и формировать напряженный активный иммунитет. Такие «горячие» вакцины (Bursin+, Bursin 2, 228Е и др) обладали повышенной реактогенно-стью для цыплят с низким уровнем трансовариальных AT, вызывали переболевание, активизировали условнопатогенную микрофлору, что вело к осложнениям и повышенной летальности. Во ВНИИЗЖ были созданы живые вакцины на базе отечественных шт. БГ и Winterfild, которые применяются в настоящее время для профилактики заболевания. Однако в ряде случаев при использовании этих вакцин наблюдались осложнения у птиц.
Стратегия борьбы с ИБ должна базироваться на эффективных ветеринарно-сани-тарных мероприятиях, а затем на эффективной специфической профилактике. В мировой практике широко используются вирус-вакцины из клонированных и в различной степени аттенуированных штаммов, обладающих разной реактогенностью. Их применяют в зависимости от эпизоотологического и иммунологического статусов птицепоголовья. Профилактику ИБ осуществляют массовой вакцинацией. Племенные стада вакцинируют инактивированной или лиофилизированной живой вакциной из умеренно иммуногенного штамма (72). В Великобритании, например, цыплятам 2—3-недельного возраста вводят «умеренную» вакцину, а по достижении возраста 16—20 недель — инактивированную эмульгированную маслянную вакцину. В Испании цыплят в возрасте 3 недель и повторно в 40-дневного возрасте прививают вакциной из шт. D-78, а в 100-дневном — инактивированной вакциной. Голландские специалисты рекомендуют различные вирус-вакцины и схемы с учетом уровня материнских AT: для бройлеров от вакцинированных родителей — вакцину из шт.228Е в возрасте 14—17 дней, а от непривитых кур — 8—12 дней; для цыплят яичных пород от вакцинированных родителей — первично в возрасте 3 недели и повторно — 4 недели; от непривитых кур первично в 2 недели и повторно — в 3-недельном возрасте; кур родительского стада прививают инактивированной вакциной в 16—20-недельном возрасте.
Сотрудники ВНИИЗЖ рекомендуют применять вакцины из шт. БГ и Winterfild в зависимости от иммунного статуса птицы. Первично прививают в 5- или 10-дневном возрасте, повторно — в 15- или 20-дневном возрасте и третий раз в 100—120-дневном возрасте жидкой инактивированной вакциной.
Большинство исследователей считают, что необходимо выяснить, какой титр пассивных AT не будет сказываться отрицательно на формировании поствакцинального иммунитета в зависимости от реактогенности применяемых вакцин и выработать единый критерий оценки. В Японии сравнительно изучена эффективность трех вакцин против высоковирулентного шт. Ehime 91. Два среднеаттенуиро-ванные шт. А и В и один промежуточный шт. С тестировали на SPF-цыплятах и промышленно выращенных цыплятах, которые имели AT. Цыплят вакцинировали в 20-дневном возрасте и через 10 дней проводили контрольное заражение шт. Ehime 91. Через 7 дней после этого оценивали уровень защиты по отношению массы фабрициевой сумки к массе тела, гистологическим изменениям и по титру специфических AT. Все три штамма индуцировали защиту у SPF-цыплят. Однако у промышленно выращенных цыплят только шт. С создавал 100 % защиту от контрольного заражения. Защитный эффект шт. А составлял 75 %, а шт. В не индуцировал защиту. Вакцинные шт. А, В и С и шт. Ehime 91 индуцировали бурсальные повреждения соответственно у 3 %, 0 %, 23 %, 61 % инокулированных промышленно выращенных цыплят. Авторами показана необходимость контроля уровня материнских AT у однодневных цыплят, чтобы определить оптимальное время вакцинации против ИБ. Отечественная сухая вакцина против ИБ из шт. БГ в условиях неблагополучного хозяйства превосходит по эффективности вакцину Гумбораль (Франция) и Гумбораль СПФ (Хорватия). Она создает напряженный иммунитет при 2- или 1-кратной вакцинации цыплят в возрасте 10 суток и старше. В практике широко применяется сухая культуральная вакцина против ИБ из шт. ВНИВИП. Препарат безвреден для молодняка птиц и обладает выраженными иммуногенны-ми свойствами. Установлено, что уровень материнских AT, соответствующий среднему по данной группе цыплят титру в ИФА 1:400, гарантирует достаточную защищенность птицы от инфекции и не препятствует эффективной вакцинации. По данным других исследователей, материнские AT недостаточны для защиты цыплят от инфекции патогенным штаммом даже если куры-несушки были раньше вакцинированы бустерными дозами инактивированной масляной вакцины. Материнские AT могут интерферировать с вакцинным шт. D-78, который способен индуцировать образование AT в высоком титре.
В настоящее время широко применяют живые вакцины из природно-ослаблен-ных штаммов, а также ослабленных путем пассирования на КЭ или в культуре клеток. Аттенуация вируса ИБ в процессе пассирования на КЭ наступала довольно быстро: после 10-го пассажа вирус терял вирулентность и иммунодепрессивные свойства, но сохранял иммуногенность. Для изготовления живой вакцины использовали вирус, пассированный в КЭ 50—60 раз. Помимо КЭ, для аттенуации вируса ИБ использовали перевиваемую культуру клеток Vero. Культуральный аттенуированный штамм хорошо приживлялся в организме 21-дневных цыплят, размножался в бурсе (около 6 lg ИД5о/мл) и выделялся с фекалиями, если они не имели AT до вакцинации. Из ат-тенуированных штаммов, адаптированных к культуре клеток куриных фибробластов, выделены клоны на основе бляшкообразования (клоны Lp u Sp). Клон Lp обладал более выраженной иммуногенностью.
Известны четыре культуральные вакцины против ИБ: Burcell, Bursine, D-78 и S-706. В опытах на цыплятах разного возраста в сравнительном аспекте определены иммуногенные и патогенные свойства пяти вакцин против ИБ: Биогамборо (Италия), CEVA (Франция), Вайнленд (США), Унивакс (США), Интервет D-78 (Голландия). Наилучшей вакциной оказалась Интервет D-78, которая индуцировала хороший иммунитет как у неиммунных, так и иммунных цыплят, не обладала иммуносу-прессивным действием и вызывала умеренные поражения тканей фабрициевой сумки. Все вакцинные штаммы способны передаваться птице при контакте. Вакцины D-78 и S-706 оказались более инвазивными, вызывали небольшую атрофию бурсы, и формирование AT в более высоком титре, в том числе, у контактной птицы по сравнению с остальными вакцинами.
Культуральные вакцины D-78 и S-706 при крупнокапельном распылении дали такие же результаты, как и при закапывании в нос и на конъюнктиву. Интересно, что дефектные интерферирующие частицы вируса ИБ вызывали раннюю защиту цыплят от инфекции вирулентного штамма гомологичного вируса до наступления иммунитета. Явление интерференции также отчетливо наблюдалось в культуре клеток. С помощью генноинженерных манипуляций получены варианты ВИББ, способные репродуцироваться в ФЭК. Методом обратной транскрипции-ПЦР амплифицированы два фрагмента кДНК (GA5 и GA3) генома штамма GZ911 ВИББ, адаптированного к ФЭК, и два фрагмента кДНК (LB5 и LB3) очень вирулентного штамма LX ВИББ, выделенного в КНР. При встраивании этих фрагментов в вектор pBssK получены плазмида GA-pBssK, несущая полноразмерную кДНК сегмента А штамма GZ911, и плазмида LB-pBssK, несущая полноразмерную копию кДНК сегмента В штамма LX. Эти полноразмерные кДНКсубклонировали в экспрессионный вектор pALTER-МАХ, несущий предранний энхансер-промотор цитомегаловируса, и получили плаз-миды GA-pALTER и LB-pALTER. При трансфекции этими плазмидами ФЭК получен рекомбинантный ВИББ (rIBDV-GA+LX).
Аналогичными приемами амплифицированы полноразмерные кДНК геномных РНК штамма НК46 ВИББ, неинфекционного для ФЭК и субклонированы на эукари-отическом экспрессионном векторе. В полученных плазмидах сконструированы замены, затрагивающие область белка оболочки VP2. При трансфекции ФЭК мутант-ными плазмидными ДНК выделены рекомбинанты ВИББ, способные размножаться на этих клетках. Показано, что они имеют замены D279N и А284Т в VP2. Замена S330R в VP2 не дает жизнеспособного ВИББ. Эти данные показали, что мутации в других вирусных белках, включая VP1, VP3, VP4 и VP5, не требуются для адаптации ВИББ к ФЭК. Недавно получен инфекционный рекомбинантный вирус (rIBDV), сохраняющий, по крайней мере, часть вирулентных характеристик сверхвируленоного IBDV. Получен также мутант вируса ИББ, содержащий в сегменте А генома нуклеотидные последовательности, кодирующие белок VP2 варианта Е. Этот мутант способен реплицироваться в культуре клеток ФЭК. На основе мутанта созданы вакцины широкого спектра действия, способные индуцировать протективный иммунитет в отношении как классических штаммов, так и штаммов варианта Е вируса ИББ.
Доказана целесообразность вакцинации цыплят против субклинического ИБ. Одно, 2- и 3-кратная вакцинация живой аттенуированной вакциной приводит к значительному увеличению чистого дохода и средней массы птицы. Несмотря на проведение полного цикла иммунизации родительского поголовья против ИБ (2-кратное применение живой вакцины + инактивированная вакцина), у 5—10 % суточных цыплят AT отсутствовали, что способствовало формированию субклинической формы заболевания. В связи с этим, разработана комплексная вакцина против ИБ и болезни Марека для применения суточных цыплятам, которая эффективно предупреждает субклиническую форму ИБ и повышает эффективность вакцинопрофилактики болезни Марека.
У разных возрастных групп птицы напряженность и длительность поствакцинального иммунитета не одинакова. Уровень специфических AT у цыплят соответствует концентрации ВНА у взрослых кур-матерей в период яйцекладки. Куры-несушки, привитые живой вакциной в 18-недельном возрасте, имели высокий титр ВНА в течение всего периода яйцекладки (30—35 недель). Цыплята, вылупившиеся из таких яиц, имели выраженный пассивный иммунитет, который обычно длится 10—15 дней.
Изучена иммуногенность и безвредность вакцин из двух штаммов JN и JH при различных дозах заражения (6, 10 и 20тыс. ТЦД50) вирулентным штаммом ВИББ DC 6/85. Защита составляла 100 % при дозе 6 для первого штамма и 10 — для второго.
Применение инактивированных вакцин. Для приготовления инактивированных вакцин вирус ИБ размножают в КЭ и культурах клеток. Концентрацию АГ вируса определяют методом двойного сэндвич-ELISA. Вирус инактивируют формалином или B-пропиолактоном, добавляют ГОА. Препарат вводят подкожно или внутримышечно. При достаточной концентрации АГ (не менее 6 lg БОЕ), инактивированная вакцина обладала выраженной иммуногенностью. Инактивированная вакцина из вируса, адаптированного к тканям фабрициевой сумки, индуцирует более высокий уровень AT в крови кур-несушек и молодняка, чем эмбрионвакцина.
На Украине разработана инактивированная вакцина для вакцинации родительских стад кур яичного и мясного направлений. Вакцину применяют за 30 дней до начала яйцекладки, внутримышечно в дозах 0,5—1,0 мл. Это обеспечивает у цыплят устойчивость к заражению до 20—25 дней жизни. В качестве вирусного сырья для изготовления вакцины используют очищенную суспензию шт. БГ, полученного на КЭ безлейкозных кур (эмбриональное сырье). Для инактивации вируса применяют ди-мер АЭЭИ. Титры AT в РДП через 14 суток после прививки вакцины из эмбрионального и бурсального сырья составляли 2,8 log2 и 4,3 log2 соответственно, а в ИФА — 1:400—1:600 и 1:400—1:6400 соответственно. Испытанные образцы инактивированной сорбированной вакцины оказались высокоиммуногенными и защищали птицу от заболевания.
Сообщается о полевых испытаниях сравнительной иммунологической активности двух серий экспериментальной эмульсинвакины БелНИИЭВ против ИБ и коммерческой вакцины такого же типа фирмы Интервет. Исследования показали, что вакцина БелНИИЭВ способна индуцировать у привитых ремонтных птиц сывороточные AT в защитных титрах и предпочтительнее вакцины Интервет. Вакцинация суточных цыплят эмульсинвакциной создавала, при наличии материнских AT и заражении их в 4-недельном возрасте вирулентным вирусом, напряженный иммунитет у 80 %, при заражении в 7-недельном возрасте — у 90 % птиц. Предложена специальная вакцина для цыплят с материнскими AT
В новом способе изготовления АГ из местных эпизоотических штаммов ИБ для инактивации применяется ультразвук или лазерное излучение. Поскольку материнские AT конкурируют с живым вакцинным вирусом и снижают иммунологическую реактивность, авторами было предложено применять для суточных цыплят инакти-вированную эмульсин-вакцину которая создает у них напряженный иммунитет в 4-недельном (85 %) и 7-недельном возрасте (90 %). Комбинированное применение инактивированной и живой вакцины не имело преимуществ перед использованием только одной эмульсин-вакцины. Материнский иммунитет у цыплят после прививки кур-несушек инактивированной вакциной был более продолжительным (2—3 недели), чем после иммунизации живой вакциной (10 дней). Материнские AT имеют период полураспада 6 дней и могут сохраняться до 30 дней.
По мнению некоторых исследователей, единственно правильным и надежным направлением борьбы с инфекционной бурсальной болезнью (ИББ) является комплексное применение новых инактивированных вакцин. Важным подходом в защите цыплят от заражения патогенными штаммами вируса ИББ в раннем возрасте является создание у молодняка высокого уровня пассивных антител путем вакцинации кур-несушек. В результате исследований по сравнительной оценке уровня материнских антител против ИББ, пассивные антитела в сыворотке крови цыплят сохраняются дольше (до 21 дня) у цыплят яичных пород, чем у цыплят мясных пород. С помощью реакции перекрестной нейтрализации были идентифицированы два изолята вируса инфекционной бурсальной болезни, гиперэкспрессирующие VP2. Изоляты принадлежат к различным серологическим подтипам. Инактивированные вакцины, приготовленные на основе этих изолятов, обеспечивали (поданным иммунологических тестов) достижение 100 %-ного уровня защиты.
При добавках в корм аскорбиновой кислоты число CD8+ в селезенке на 7-й день жизни и lgM-клеток в фабрициевой сумке на 7-, 21- и 31-й дни жизни было значительно выше, чем в контроле. Продукция интерлейкина-2 спленоцитами при добавках аскорбиновой кислоты была выше, чем в контроле. Число клеток, секретирующих специфические IgG, в селезенке на 21- и 31-й дни жизни было значительно выше, чем в контроле. Эта добавка может смягчить иммуносупрессию, вызванную вакцинацией, и активизировать гуморальный и клеточный иммунитет.
Генноинженерные (молекулярные) вакцины. Самым важным по иммуногенным свойствам оказался белок 35000 Д. Ген, кодирующий этот белок, встроенный в генетический аппарат E. Coli или дрожжевой клетки, индуцирует образование этого белка, который в очищенном и концентрированном виде представляет высокоэффективную, абсолютно безвредную вакцину. Получена рекомбинантная субъединичная вакцина, в которой основной протективный иммуноген — белок VP2, продуцируемый в высокоиммуногенной форме находится в дрожжах Scecharomyces cerevisiae. Рекомбинантный белок VP2 в виде мясляно-эмульсионной вакцины индуцировал ВНА и ELISA регистрируемые AT у кур, которые передавались потомству и предохраняли цыплят от заражения вирулентным вирусом. Рекомбинантная субъединичная вакцина индуцировала AT-ответ такого же уровня, который наблюдался у кур при введении им живого вируса. Поэтому считают, что рекомбинантный субъединичный препарат впоследствии должен вытеснить используемые в повседневной практике инактивированные вакцины. При вакцинации суточных цыплят наиболее выраженный иммунитет (не менее чем у 90 % привитых) наступает при введении живой вакцины, а спустя 24 дня — инактивированной. Прививка кур в 8—12-недельном возрасте живой вакциной усиливает иммунный ответ на введение инактивированной вакцины в более поздний период. Создан высокоиммуногенный пептид VP2 вируса ИБ в виде агрегированной формы, состоящей из нескольких пептидов.
Кроме вакцинопрофилактики, за рубежом в лабораторных условиях с положительными результатами были испытаны монАТ, полученные, в основном, на эпитопы протеина VP2 (VP2a и VP2b), ответственные за индукцию ВНА, а также на протеин VP3. AT на VP2a и VP2b предупреждали развитие инфекции у зараженных SPF-цып-лят в 100 % Случаев, а на VP3 — всего лишь в 22 %.
Изучена возможность использования белков ВИББ, экспрессированных в бакуло-вирусе, в качестве антигенов в методе EL1SA. Тестировали три белка ВИББ: укороченный VP2, цельный VP2, полипротеиновый комплекс VP2, VP3 и VP4. Результаты ELISA сравнивали с процентом защиты этих птиц от контрольного заражения ВИББ. На 7-й день после контрольного заражения оценивали отношение массы бурсы к массе тела птицы. Процент защиты определяли по количеству птиц с относительно нормальной массой бурсы в каждой контрольно зараженной группе, по сравнению с незараженным контролем.
Не установлено связи между результатами ELISA, полученными при анализе полипротеинового комплекса антигена (VP2, VP3 и VP4), и процентом защиты от контрольного заражения против штаммов STC и Del-E. Получен мутантный вирус инфекционной бурсальной болезни, который содержал в сегменте А генома нуклеотидные последовательности, кодирующие белок VP2 варианта Е. Мутант оказался способен репродуцироваться в культуре клеток фибробластов куриного эмбриона. На основе этого мутанта создана вакцина широкого спектра действия, способная индуцировать протективныи иммунитет в отношении, как классических штаммов, так и штаммов варианта Е вируса инфекционной бурсальной болезни.
Значительная связь между результатом ELISA и процентом защиты от STC и Del-Е обнаружена при использовании укороченного или цельного VP2. Результаты исследования показали, что прогнозирование процента защиты вакцинированных бройлеров от классического или вариантных штаммов ВИББ возможно только при использовании антигена VP2 и метода ELISA. Ген VP был изолирован из вирулентного штамма и клонирован в прокариотной (Escherichia coli) и эукариотной (бакуловирус) системах. Белок, экспрессируемый в обеих системах, имел приблизительно 32 кДа и распознавался антителами к ВИББ. Частично очищенные полипептиды вводили интактным птицам, у которых вырабатывался высокий уровень антител к ВИББ, обнаруживаемых с помощью реакции иммуноблотинга и ELISA. Однако антитела к рекомбинантному VP3 не предотвращали изменений в бурсе, не снижали уровень гибели цыплят после контрольного заражения вирулентным штаммом ВИББ. Следовательно, полипептид VP3 не может быть использован в качестве субъединичной вакцины против ВИББ и поэтому предстоит исследовать природу нейтрализующего эпи-топа этого структурного белка вируса.
Разработана система для продукции живого непатогенного инфекционного ВИББ из синтетических транскриптов клонированной кДНК. Сконструированы полноразмерные клоны кДНК, содержащие кодирующие и некодируюшие области сегментов РНК А и В генома ВИББ. Сегмент А модифицирован для предотвращения экспрессии белка NS. Синтетическую РНК обоих сегментов можно получить транскрипцией in vitro линеаризованных плазмид РНК-полимеразой фагаТ7. Инфекционный ВИББ продуцируется через 36 ч после трансфекции клеток Vero смесью (+)-транскриптов обоих сегментов. Эта система, порождающая дефектный вариант ВИББ, полезна для изучения иммуносупрессии при заражении ВИББ и для разработки живых аттенуи-рованных вакцин против ВИББ. Создана ДНК-вакцина для защиты разных видов птиц от вируса инфекционного бурсита птиц, которая основана на перспективной иммунизации некоторым количеством вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полппептиды ВИББ (VP1— VP5f и 2), подходящий носитель и (или) адъ-ювант.
Серологическая оценка постващинального иммунитета. Динамика изменения титра поствакцинальных AT на живую и инактивированную вакцину, по данным ИФА, и РН, имела сходный характер, а корреляция (г) составила 0,6. Преципитирующая активность в агаровом геле регистрировалась выше лишь в ИФА-позитивных сыворотках и пробах с определенным титром ВНА.
Лучшие результаты получены при выпаивании живой вакцины в 2—5-недельном возрасте, а в 20-недельном возрасте — от применения инактивированной вакцины. В ФРГ (Дессау) при сравнении аэрозольной и пероральной иммунизации получены сходные результаты. Пассивно иммунные цыплята были устойчивы к заражению вирусом ИБ в возрасте 7, 14, а иногда и свыше 20 дней, в зависимости от уровня и длительности сохранения материнских AT. Пассивные ПА выявляли до 13-недельного возраста у цыплят, полученных от однократно вакцинированных птиц. AT сохранялись на 4 недели дольше, если кур вакцинировали дважды. Однако это не увеличивало уровня иммунитета. У цыплят активный иммунитет развивался недостаточно, если уровень приобретенных материнских ВНА у них был около 7 iog2. Если тиры AT были ниже этого уровня, то вакцинация приводила обычно к репликации вируса в фабрициевой сумке при сильном ее поражении и последующем развитии активного иммунитета.
Установлено, что инкубационные яйца, полученные из хозяйств, неблагополучных по ИБ, невосприимчивы к этому агенту. Эта особенность была использована для определения степени благополучия птицеводческих хозяйств в ФРГ. Когда от вируса ИБ погибало свыше 75 % зараженных эмбрионов, считали, что они полностью восприимчивы к вирусу, а хозяйства, из которых были получены яйца, относили к полностью благополучным. Партии инкубационных яиц, где гибель эмбрионов составляла 25—75 % и 0—25 %, Относили соответственно к частично восприимчивым и полностью невосприимчивым, а хозяйства — к числу неблагополучных по ИБ. Поскольку вирус ИБ поражает иммунную систему птиц, ответственную за выработку гуморального иммунитета, косвенным показателем благополучия хозяйства могут служить результаты исследования продукции накопления AT в сыворотке крови птиц после вакцинации их против ИБ. В этом случае в неблагополучном по ИБ хозяйстве вакцинация против ИБ не вызывает образования и накопления AT, при этом у 30—80 % обследуемых птиц титры ГА были ниже 1:8, а индекс нейтрализации — ниже 2 lg.
В США для профилактики ИБ все поголовье в возрасте 14 дней прививают живой вакциной Burgine, которую дают с питьевой водой. Ревакцинацию проводят в 35-дневном возрасте. Третья вакцинация — в 17 недель масляной адсорбатвакци-ной. По сравнению с живой она гарантирует более продолжительную защиту родителей и более высокий титр материнских AT. Применяющаяся на родительском стаде кур эмульсин-вакцина приводит к образованию высокого уровня ПА. Цыплята, полученные от таких кур, также имеют высокий уровень гуморальных AT. Введение на фоне базового иммунитета от живой вакцины инактивированной вакцины обеспечивает формирование у цыплят в первые недели жизни высокого уровня невосприимчивости, достигаемого накоплением в яйце значительного количества материнских AT (титр их 1:4000 в РН в культуре клеток). Последующее введение масляной вакцины доводит этот показатель до 1:100000. Активную иммунизацию целесообразно проводить только при содержании в крови AT в титрах не ниже 1:64.
Контроль формирования поствакцинального иммунитета против ИБ целесообразно осуществлять с помощью РН и РДП. У всех цыплят, привитых живой вакциной, AT в сыворотке крови появлялись, начиная с 3—4 недель и обнаруживались в РН и РДП. ПА после вакцинации в 4—5-недельном возрасте они выявлены в среднем у 67,8 % кур до 46-недельного возраста. Материнские AT сохранялись у цыплят до 10 дней (в РДП) и до 20 дней (в РН). У 80-100 % цыплят, полученных от вакцинированных кур, обнаруживали ПА, но к 17-дневному возрасту они исчезали. Материнские AT передавались трансовариально и выявлялись в сыворотке крови цыплят в 1-,11-Д9-и 25-дневном возрастах у птиц соответственно: в РН — у 86, 72, 30 и 22 % (титр 1:16 и выше), в РДП — у 88, 69, 5 и 0 %. У суточных цыплят положительная РН составляла 52,5 %, что свидетельствовало о наличии материнских AT. В возрасте 30 дней число серопозитивных цыплят снижалось до 4,7 %. Цыплята, полученные из яиц ферм, где болезнь регистрировалась, содержали материнские AT в течение 15 дней.
Как постинфекционные, так и поствакцинальные AT выявляются в РН. Так, при заражении молодых чувствительных цыплят вирусом ИБ получают хороший серологический ответ. Определен иммунный ответ у цыплят различного возраста через 3 недели после их заражения вирусом. Цыплята, иммунизированные в 4-недельном возрасте, имели ИН 3,5, в то время как ИН у 3-дневных вакцинированных цыплят находился в более низких пределах — 1,5—2. Взрослые птицы, так же как и молодые цыплята, слабо реагируют на вводимый АГ, возможно, из-за отсутствия функциональной активности бурсы Фабрициуса. Птица считается устойчивой к инфицированию вирулентным вирусом при титре AT в РН, равном 2 lg и выше, а в РДП — не ниже 1:8. 100 %-ную устойчивость цыплят наблюдали через 3 дня после их вакцинации вирусом Сu-1М. Титр AT у них в РН составлял 1:8, через 7 дней — 1:8000.
Серологические исследования проб крови 32 групп кур и одной группы индюков различного возраста проведены в 1999—2000 гг. В 25 группах птиц были изучены живая и инактивированная вакцины против вируса инфекционного бурсита (ВИБ). Не вакцинировали птиц 8 групп. Во всех 33 группах у птиц установлен положительный титр специфических антител против ВИБ. Средний геометрический титр (G) антител в каждой группе широко варьировал от 565 до 14 403 (положительный титр >554). Средний титр проб крови птиц вакцинированных групп был выше, чем средний титр проб невакцинированных птиц, но разница статистически недостоверна.
Что касается защитной роли пассивных материнских AT у цыплят, полученных от кур-реконвалесцентов или иммунизированных вакцинами, то в этом отношении имеется однозначная трактовка: пассивные AT задерживают размножение вируса независимо от пути его инокуляции в КЭ. Передача родительских AT цыпленку подоб-* ным образом защищает его от заражения. Для оценки эффективности иммунитета, стимулированного вакцинами на степень разрушения бурсы, предложено использовать морфометрический анализ. Для этого измеряют общую площадь и интегральную АГ плотность соседних фолликул на окрашенных гемотоксилинэозином гистологических срезах бурсы трех групп цыплят: невакцинированных незараженных (I), невакцинированных зараженных вирулентным вирусом (II), вакцинированных зараженных вирулентным вирусом (III). Заражение вирулентным вирусом проводят через 15 дней после вакцинации, а морфометрический анализ — через 10 дней после заражения. Общая площадь 10 фолликул у цыплят I, II и III групп составляла соответственно 6,25Т04, 5,54Т04 и 2,27Т04 мк, а интегральная АГ плотность — соответственно 392102, 254102 и 147-102 ед.
Для определения титра AT и АГ ИБ предложен также метод ВИЭФ. В качестве АГ используют гомогенат бурс от больных птиц в разведении 1:32 и сыворотки от переболевших и вакцинированных птиц. Метод ВИЭФ может быть с успехом использован для экспресс-диагностики ИБ и быстрой оценки иммунного статуса птиц.