Для микроскопического исследования крови пользуются препаратами, приготовленными на обыкновенных предметных стёклах. Однако, при этом отдают предпочтение ещё не бывшим в употреблении стёклам с ровной, гладкой поверхностью, без царапин, выпуклостей, шероховатостей. Все эти недостатки неминуемо отражаются на мазке (неравномерность распределения форменных элементов, оседание краски и т. д.). В случае нужды пользуются иногда и старыми стёклами после тщательной очистки и мытья их, бракуя и выбрасывая все непригодные.

Для приготовления хорошего мазка требуются тщательно приготовленные стёкла, хорошо обезжиренные, очищенные от следов кислот и щелочей. Новые, ещё не бывшие в употреблении стёкла, очищают от пыли и механических частиц в холодной воде, затем протирают щёткой в тёплой воде и после этого промывают в течение 2—3 часов довольно сильной струёй воды. После промывания стекла перетирают сухой и мягкой полотняной тряпочкой и сохраняют в широкогорлых склянках в смеси спирта с эфиром (ana partes). Стёкла, бывшие в употреблении, после удаления (кусочком смоченной в бензине ваты) кедрового масла, очищают в тёплой мыльной воде и после нагревания при температуре 50—70° на водяной бане выдерживают в течение нескольких дней в хромовой смеси, после этого их прополаскивают в проточной воде. Перед употреблением стёкла извлекают из сосуда при помощи пинцета и тщательно, не касаясь рукой поверхности, вытирают чистой тряпочкой.

Большое значение имеет затем подготовка операционного поля; небрежности в этом отношении также отражаются на свойствах мазка. Она состоит в том, что на довольно большой поверхности кожи выстригают гладко шерсть, так, чтобы стекло при взятии крови не приходило в соприкосновение с отдельными волосками. Кожу недолго массируют, протирают основательно спиртом для удаления кожного сала и затем осторожно очищают поверхность эфиром. Наиболее удобным местом операции у всех животных считают обыкновенно наружную или внутреннюю поверхность уха. При местном спазме сосудов, довольно частом при лихорадке, кровь добывают путём укола кожи верхней или нижней губы.

 

Для получения капли крови пользуются обыкновенно колющими инструментами— оспенной иглой, иглой Дженнера, иногда флицем, концом скальпеля; для мелких животных очень удобна игла Франка. Конечно, инструменты должны содержаться в надлежащей чистоте. Иглы Франка очищаются обыкновенно спиртом или эфиром, остальные инструменты после механической очистки лучше простерилизовать.

Первую каплю крови, выступившую после прокола кожи, стирают тщательно ваткой. Вторую используют для изготовления мазка, исследования на гемоглобин, подсчёта эритроцитов и т. д. Кровь нужно использовать, по возможности, быстрее, пока она ещё не потеряла своих физических свойств. Быстро наступающее свёртывание крови делает приготовление хорошего мазка совершенно невозможным.

Самый процесс приготовления мазка, т. е. взятие крови и её размазывание по поверхности стекла, заслуживает также большого внимания. Различные промахи и отступления от принятой методики сильно отражаются на качестве препарата, делая его часто совершенно непригодным для исследования. Неудивительно поэтому, что первые попытки учащегося приготовить хороший мазок обычно кончаются неудачей.

В момент нанесения материала предметное стекло удерживают в правой руке, зажав его рёбра между большим и указательным пальцами, и осторожно приводят в соприкосновение с каплей крови. Как только капля «села на поверхность», сейчас же берут стекло в левую руку и удерживают за короткие рёбра

Рис.  Приготовление мазка крови.

Между большим и указательным пальцами . Правой рукой захватывают затем покровное или узкое шлифованное стекло, ставят его на предметное, ближе к капле крови, под углом в 45° и осторожно приводят в соприкосновение с кровью, которая быстро распределяется полосой в образовавшемся углу. Осторожно, стараясь не травматизировать клетки приготовляемого мазка, с некоторым, однако, нажимом и достаточно быстро, двигают его к противоположному концу. Следуя за движением руки, кровь покрывает поверхность предметного стекла равномерным и тонким слоем.

С целью выбраковки негодных препаратов обращают внимание на длину, ширину, густоту мазка и равномерность распределения крови по стеклу. Хороший мазок должен быть достаточно длинным, тонким, по возможности, равномерным, без просветов, пустот. Кроме того, мазок должен быть уже предметного стекла, иметь ровные, вытянутые по прямой линии края и конец, постепенно, без резких зазубрин, сходящий на-нет.

Зимой и осенью только что приготовленные препараты следует защищать от действия паров воды, так как конденсирующиеся на холодной поверхности стекла пары быстро их гемолизируют. Летом мазки повреждаются мухами, которые жадно набрасываются и быстро пожирают свежеразмазанную кровь. Успевшие уже высохнуть препараты нумеруют с обозначением даты и завёртывают в длинную полосу бумаги или сохраняют в особых шкафах, ящиках или папках. Номер и дату наносят обыкновенным пером или булавкой посредине мазка. Другие способы — наклейка, записи пишущими на стекле карандашами и чернилами, записи на бумаге — менее удобны.

При дальнейшей обработке и хранении удачно приготовленных мазков следует тщательно оберегать их от насекомых, действия влаги, обычных для лабораторий паров кислот и щелочей, дыма, различных газов. Все эти недочёты хранения мазка сильно отражаются на окраске, делая порой негодными хорошо приготовленные препараты.

Целый ряд чисто физиологических факторов — работа, беспокойство животного, процесс пищеварения — находит своё отражение в крови, внося в неё порой довольно существенные изменения. Чтобы устранить до некоторой степени влияние этих факторов, затрудняющих правильную оценку картины крови, рекомендуют выработать однообразную методику взятия проб крови. Мазки приготовляют в определённое время дня, лучше рано утром, до дачи корма, при строгом учёте указанных влияний.

Фиксация мазка. Наиболее надёжным способом закрепления является фиксация препарата метиловым спиртом. Мазок крови погружают в кюветку с налитым в неё абсолютным метиловым спиртом, покрывают крышкой и выдерживают в течение 3—5 минут. Способ фиксации в кюветке удобен, потому что допускает одновременную обработку нескольких (до 4) препаратов.

Кроме метилового спирта, пользуются и другими фиксаторами: абсолютным этиловым спиртом (20—30 минут), чистым ацетоном (5 минут), смесью, спирта с эфиром в равных пропорциях (10—20 минут), 1% раствором осмиевой кислоты (V3—1 час).

Фиксации нагреванием требует лишь окраска по Эрлиху. Обработку препаратов жаром производят в сушильном шкафу, температуру которого в течение 1—1'/2 часов постепенно доводят до 120°. При некотором опыте фиксация удаётся на согревательном столике при помощи спиртовой горелки.

Окраска по Май-Грюнвальду и Лейшману не требует предварительной фиксации, так как закрепляющие элементы содержатся в самой краске.

Окрашивание также требует немало внимания и опыта исследователя. Следует помнить, что прекрасно приготовленный и хорошо фиксированный мазок может быть совершенно испорчен при окраске. Причинами неудач являются то низкие качества краски, то некоторые погрешности методики окрашивания.

Окраска по Гимза. Пользуются готовым раствором красящего вещества, выпускаемого в продажу под названием краски Гимза. Для окрашивания одного препарата берут 5 куб. см усреднённой воды, прибавляют к ней 5 капель раствора Гимза и осторожным покачиванием размешивают окрашиваются в аметистовый цвет жидкость. Препарат помещают на стеклянных палочках над подставной чашкой, мазком вверх, и покрывают всю его поверхность только что приготовленным раствором.

Красящее вещество постепенно разлагается с выпадением тёмнофиолетового осадка, вследствие чего жидкость медленно обесцвечивается. Продолжительность окраски зависит от качества красящего вещества, концентрации раствора, температуры и влажности воздуха, а также от качества воды. Летом мазки окрашиваются быстрее (15—20 минут), зимой препарат приходится выдерживать несколько дольше (20—30—40 минут). По окончании срока раствор краски, значительно уже разложившийся, смывают лёгкой струей усреднённой воды, не касаясь препарата руками. Только при этом условии можно избежать порчи мазка оседающими частицами разложившегося раствора. Хорошо отмытый препарат высушивается в вертикальном положении и затем погружается на несколько секунд в спирт для лучшей диференциации ядра. Не смывая алкоголя, препарат затем быстро высушивают и исследуют под микроскопом.

Правильно окрашенный мазок имеет тонкий красновато-фиолетовый оттенок. Перекрашенные мазки — густого тёмнофиолетового цвета. Такие же тона дает щелочная окраска. Недокрашенные препараты, а также мазки, обработанные несвободной от кислот дестиллкрованной водой, легко узнать по грубо-красному оттенку их поверхности. Способ Гимза, технически довольно простой, даёт прекрасную окраску всех форм белой крови, резко оттеняя присущие им особенности.

Окраска по Май-Грюнвальду. Поверхность мазка покрывают 20—25 каплями раствора Май-Грюнвальда, кстсрый быстро, в течение 3 минут, фиксирует мазок. Так как краска быстро испаряется, нужно следить, чтобы поверхность мазка не высыхала. Через 3 минуты краску разводят, приливая 3—5 куб. см нейтрализованной воды, и окрашивают в течение 1 минуты. Спустя минуту водный раствор краски сливают, не смывая дестиллированной водой, остаток удаляют осторожно пропускной бумагой и покрывают поверхность мазка обычным раствором Гимза. Через 20 минут краску смывают струёй усреднённой воды и препарат высушивают.

Окраска по Лейшману (Leichann) является одним из наиболее удобных и быстрых методов. Предварительной фиксации не требуется. Препарат покрывают раствором Лейшмана (15—20 капель) на 5 минут, затем, не смывая краски, осторожно приливают по каплям равное количество дестиллированной воды (капля на каплю) и при помощи кисточки осторожно размешивают жидкость. Через 10 минут, раствор краски удаляют струёй дестиллированной воды. Очистив таким образом, препарат выдерживают в течение 2 минут под слоем воды, споласкивают и высушивают.

Окраска по Эрлиху даёт прекрасное окрашивание зернистости лейкоцитов. Препараты фиксируются сухим жаром при температуре 110—120° в течение одного часа и окрашиваются 10—15 минут триацидом Эрлиха. После смывания краски дестиллкрованнои водой препараты высушиваются на воздухе.

Витальная окраска (по Uиллингу) прекрасно выявляет substantia granulo-f larrtntopa в эритроцитах. Для окраски употребляют насыщенный раствср brillant kresyltlau в аСсолютнсм спирте (1 : 80). Каплю краски наносят на поверхность предметного стекла, чуть подогретого проведением через пламя спиртовой горелки, и затем размазывают так же, как и при приготовлении мазков крови. Распространяясь по стеклу, краска оставляет серовато-фиолетовый налет на поверхности стекла. Обработанные таким образом стёкла довольно долго сохраняются и в нужный момент могут быть всегда использованы.

В момент приготовления мазка на стекло, покрытое высохшей краской, наносят каплю крови, размазывают её обычным способом и затем быстро, пока мазок ещё не подсох, переносят его на 5—10 минут во влажную камеру для окраски substantia granulo-filamentosa. Роль влажной камеры выполняет чашка Коха или небольшой эксикатор, на дно которых положен небольшой кусочек ваты, смоченной водой. Вынутый из камеры мазок высушивают на воздухе, фиксируют 3 минуты метиловым спиртом и затем окрашивают дополнительно обычным способом по Гимза.

Приготовление и окраска толстой капли. Исследование толстой капли производят с целью установить присутствие в крови паразитов, особенно при подостро протекающих, а также хронических протозой-ных заболеваниях, когда обычный просмотр мазка не даёт должных результатов. Очень удобен также этот метод исследования для определения количества эозинофилов. Иногда им пользуются для подсчёта тромбоцитов, а также выявления некоторых характерных особенностей клеток крови (полихромазия эритроцитов).

Рис. Толстая капля.

Для приготовления препарата берут на предметное стекло крупную каплю крови, тотчас же размазывают её препаровальной иглой до величины гривенника и высушивают тщательно на воздухе в течение нескольких часов. Для окраски применяют оэыч-ный раствор Гимза, которым покрывают хорошо высушенный нефиксированный мазок. Краска быстро гемолизирует эритроциты и, разлагаясь, даёт красное облачко на поверхности жидкости. Чтобы избежать выпадения осадка, раствор Гимза через 3 минуты, т. е. после того как закончился гемолиз, осторожно сливают, приподнимая для этого слегка один край чашки, над которой производится обработка мазка. Остатки первой порции краски смывают, осторожно приливая сбоку только что приготовленный новый раствор Гимза (1 капля на 1 куб. см воды), затем снова, опустив чашку, придают мазку горизонтальное положение, осторожно покрывают его поверхность свежим раствором и окрашивают в. течение 25—30 минут. С теми же предосторожностями, стараясь не попортить поверхности толстой капли, смывают, наконец, краску лёгкой струёй воды и высушивают препарат, придав ему вертикальное положение.

При удачной обработке сергдина капли окрашивается в синеватый или голубоватый цвет, в то время как края её получают красновато-фиолетовый оттенок. Грязнофиолетовая окраска получается в сильно перекрашенных препаратах, а так же при щелочной реакции воды.

В правильно окрашенной толстой капле должны быть достаточно ясно выражены характерные особенности каждой клетки. При плохой окраске картина неясная: ядра клеток очень плохо выражены, зернистость не отчётлива, тромбоциты еле заметны.