Ознакомление с микроскопированием мазков.

Изучить морфологию микроорганизмов: а) приготовление препаратов, б) окраска препаратов.

Изучение морфологии микроорганизмов.

Бактерии. Морфология бактерий зависит от условий выращивания на питательных средах, температуры и других факторов. Наиболее типична морфология бактерий в молодых культурах. По форме бакте­рии делятся на шаровидные, палочковидные и извитые.

К морфологическим свойствам относятся не только форма, но и размер клеток, наличие спор и капсул, подвижность и характер окрас­ки бактерий по Граму. Для изучения морфологии бактерий в лабора­ториях готовят препараты.

Приготовление препаратов. Препараты (мазки) готовят из бактериальных культур. Бактериальная чистая культура - это по­томство одной микробной клетки, т. е. расплодка одного вида микро­ба (без примеси других), выросшая на питательной среде.

При приготовлении препаратов из культуры бактерий, выросших на питательных средах, необходимо соблюдать правила стерильности. Пробирку с культурой берут в левую руку, помещают между большим и указательным пальцами и держат в наклонном положении. Бакте­риологическую петлю (металлическая или платиновая проволока на стержне) берут правой рукой и прокаливают на пламени горел­ки или спиртовки. Мизинцем правой руки вынимают ватно-марлевую пробку из пробирки и держат ее, не касаясь окружаю­щих предметов около пламени горелки. Края пробирки слегка обжи­гают на пламени, вносят стерильную петлю в пробирку, охлаждают ее, не прикасаясь к внутренним стенкам. Затем набирают небольшое количество культуры, вынимают петлю из пробирки, которую закрывают пробкой, пронося предварительно через пламя горелки. Пробир­ку ставят в штатив и приступают к приготовлению мазка.

Для приготовления препарата из бульонной культуры на чистое, обезжиренное предметное стекло стерильной петлей наносят каплю взвеси и равномерно распределяют ее по поверхности стекла в форме мазка размером 1,5-2,5 см.

Если препарат готовят из культуры, выращенной на плотной питательной среде, то вначале на стекло наносят каплю стерильной воды, а затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры и тщательно растирают.

После нанесения культуры на стекло бактериологическую петлю прокаливают над пламенем горелки, а препарат высушивают на воздухе, затем фиксируют на пламени, проводя 3-4 раза тыльной стороной стекла (мазком вверх) через пламя горелки. При фиксации микроорганизмы погибают и прикрепляются к стеклу. Мертвые клет­ки окрашиваются лучше, чем живые.

Окраска препарата. Фиксированный препарат окрашивают, так как при рассматривании под микроскопом неокрашенных мазков микробные клетки не видны. Для окрашивания бактерий в лаборато­риях применяют рабочие (водные) растворы анилиновых красителей (метиленовой сини, фуксина основного, сафранина, малахитовой зелени и др.). Краски разливают в специальные склянки с пипетками.

Бактерии окрашивают Простым и сложным методами.

Простой метод окраски проводят следующим образом: на фикси­рованный мазок наносят 2-3 капли водного раствора одного красите­ля (например, фуксина или метиленового синего) и окрашивают в течение 2-3 мин. Затем краску смывают, препарат тщательно промы­вают водой и просушивают между листками фильтровальной бумаги и рассматривают под микроскопом. Для приготовления и окраски препаратов используют установку для промывания препаратов (рис. 2). На подставку помещают бутыль, промывают препараты на мостике, расположенном на сливной чашке.

При Сложном методе окраску проводят дву­мя или более красителями. Сложные методы окраски бактерий основаны на физико-химичес­ких свойствах микробной клетки. Их применя­ют для детального изучения строения бактерий и их различия. Наиболее распространенным сложным методом окраски микробов является метод Грама, предложенный в 1884г. Для окраски по Граму на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, наносят 2-3 капли генцианвиолета на 1-2 мин,

Рис.2

Снимают пинцетом бумажку, сливают остаток краски и наливают 2-3 капли раствора Люголя на 1-2 мин. Затем раствор сливают и на мазок наносят несколько капель этилового спирта-ректификата на 30-40 с. После этого мазок промывают водой и окрашивают фуксином (2-3 капли раствора на 1-2 мин). Препарат тщательно промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и рассматривают под микроскопом с иммерсионным объективом.

Одни бактерии по методу Грама окрашиваются в фиолетовый цвет (грамположительные), другие - в розовый цвет (грамотрицательные). Различие окраски бактерий обусловлено неодинаковым химическим составом клеточной стенки. У грамположительных бактерий больше муреина (до 95 %), чем у грамотрицательных (всего 5-10 %).

1) клеточных стенках грамположительных бактерий муреин связан в основном с полисахаридами, среди которых большое место занимают тейхоевые кислоты. Такой химический состав клеточной стенки прочно удерживает фиолетовый краситель и не обесцвечивается спиртом.

В клеточных стенках грамотрицательных бактерий муреин связан и основном с липидами. Тейхоеные кислоты отсутствуют. Микробная клетка таких бактерий не обладает способностью прочно удерживать фиолетовую окраску. При обработке спиртом обесцвечивается, и дополнительная окраска фуксином придает клетке розовый цвет.

Окраска спор. Для окраски спор в лабораториях часто поль­зуются методом Меллера, Шсффера-Фултона и др.

Метод Меллера заключается в следующем. На фиксированный над пламенем мазок наносят несколько капель 5 %-ного раствора хромовой кислоты на 3-5 мин. Затем промывают водой, высушивают. На мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят 3-4 капли карболового фуксина Пиля, окрашивают с подогреванием (до появле­ния паров) в течение 3-5 мин. Краску смывают и мазок обесцвечивают 5 %-ным раствором серной кислоты в течение 30-40 с. Мазок вновь промывают водой и окрашивают раствором метиленового синего в течение 1-2 мим. После промывания водой и высушивания фильтро­вальной бумагой мазок рассматривают под микроскопом. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные части клетки - в синий.

Метод Шеффера-Фултона заключается в следующем. Фиксированный мазок окрашивают 5 %-ным раствором малахитовой зелени с подогревом до появления паров в течение 1-2 мин. Затем препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 0,5 %-ным водным раствором сафранина в течение 1 мин. Остаток краски смы­вают водой и мазок просушивают фильтровальной бумагой. При микроскопии в поле зрения микроскопа споры выглядят зелеными, вегетативные формы - красными.

Окраска капсул. В лабораториях часто проводят исследова­ния для выявления капсул. Капсула плохо воспринимает окраску и при простых методах окраски не выявляется. Капсула хорошо окра­шивается по методу Романовского-Гимза, Муромцева и др. Метод Романовского-Гимза заключается в следующем. Фиксированный мазок окрашивают краской фабричного изготовления, в которую входят азур и эозин. Краску разводят водой 1:10 и препарат окраши­вают в течение 20-30 мин. Затем мазок промывают, просушивают фильтровальной бумагой. Капсула окрашивается в розовый цвет, тело микробной клетки - в синий.

По Методу Муромцева фиксированный препарат окрашивают готовой краской Муромцева 20-30 с, промывают водой и высушивают. Капсулы окрашиваются в бледно-розовый цвет, микробная клетка - в темно-синий.

Плесневые грибы. Для изучения морфологии плесневых грибов готовят препараты методом раздавленной капли, а для определения подвижности микробов - методами раздавленной капли и висячей капли. Затем препараты рассматривают под микроскопом с объекти­вом 8 и 40 при слегка опущенном конденсоре.

Метод Раздавленной капли основан на следующем. На середину чистого, обезжиренного предметного стекла наносят бактериологичес­кой петлей каплю культуры микроорганизмов, выращенную в жидкой питательной среде, осторожно накрывают покровным стеклом. Капля тонким слоем заполняет пространство между покровным и предмет­ным стеклом.

Для приготовления препарата из культуры микробов, выращен­ных на плотной питательной среде, вначале на предметное стекло наносят каплю стерильной воды, а затем в нее вносят небольшое количество изучаемых микроорганизмов и накрывают покровным стеклом.

Метод Висячей капли заключается в следующем. Культуру микро­организмов наносят бактериологической петлей на покровное стекло, а к нему прикладывают предметное стекло с углублением (лункой). Края лунки предварительно смазывают вазелином, чтобы прикрепить покровное стекло. Для рассматривания под микроскопом препарат помещают на предметный столик покровным стеклом вверх, т. е. к объективу. Капля свободно висит в луночке и долго не высыхает, что позволяет длительное время наблюдать за подвижностью микробных клеток.

При изучении морфологии плесневых грибов на предметное стекло необходимо нанести каплю воды и из культуры двумя препароваль­ными иглами (иглы, закрепленные в деревянные палочки) внести небольшой кусочек мицелия гриба. Его осторожно расщепляют на стекле, не разрушая гифов, спорангиеносцев, конидиеносцев, накры­вают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом.

Мукор (головчатая плесень) - Одноклеточный плесневый гриб. Спорангиеносцы расположены одиночно, реже кустиками. Мицелий пушистый, в верхней части образует множество черных головок. Споры серые, округлой или овальной формы, при микроскопировании просвечиваются.

Пенициллиум - Плесневый гриб, конидиеносцы имеют перегородки, разветвленные в виде кисточек, на концах ветвей расположены стеригмы, а на них округлые, гладкие споры в виде цепочек (конидии). Мицелий низкий, врастает в питательную среду. Колонии плесени окрашены в зеленый цвет.

Аспергиллюс - Плесневый гриб, конидиеносец одноклеточный без перегородок. Стеригмы располагаются на булавовидном утолщении конидиеносца. От стеригм отходят по радиусам споры (конидии) округлой формы черного цвета.

Молочная плесень — Мицелий белого цвета с перегородками. Конечные нити мицелия распадаются, образуя споры круглой, оваль­ной и прямоугольной форм (оидии).

Гроздевидная плесень - Конидиеносец многоклеточный. От него отходят круглые оливково-зеленые овальной формы конидии, распо­лагающиеся в гроздевидные скопления. Колонии плесени окрашены в черный цвет.

Шоколадная плесень - Конидии шоколадно-коричневого цвета, образуют длинные в виде бус цепочки.