Болезнь Марека

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 5.00 (2 Голоса)

[Polinevritis interstinalis chronica, Polinevritis gallinarum (лат.); Fowl or range paralisis, neural, okular, (grey or paerly Eye) and vaskular lymphomatosis, Marek's leukosis, Marek's Disease, Polynevritis, Neurolymphomatosis galinarum (англ.); Seuchenhafte Hirn-Ruckenmark-Nervenentzundung der Huhner Infectiose, Anstecende oder Mareksche Huhnerlahme Oder Huhnerlahmung, Herpesvirus-B-infektion des Huhnes (Marek) (нем.); La maladie de Marek classique et aigue (франц.); Enfermedad de Marek (исп.).]

Болезнь Марека (БМ, нейролимфоматоз птиц, паралич птиц, энзоотический ней-роэнцефаломиелит птиц) — высококонтагиозная вирусная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в двух формах: классической (поражение периферической и центральной нервной системы) и острой (лимфоидный лейкоз). Заболевание впервые описал в 1907 г. Ж. Марек, венгерский ветеринарный патолог, профессор Королевского Венгерского университета.

Хотя вирусная природа этой болезни предполагалась давно, до 1967 г вирус не был открыт. В 1967 г. три группы ученых, в Великобритании, и США одновременно и независимо друг от друга выделили от больных в культуре клеток герпесвирус цыплят и предоставили доказательства, указывающие на этиологическую роль этого агента. В настоящее время определенно установлено, что ВБМ относится к роду Herpesvirus группы В и является клеточно-связанным вирусом.

Многочисленные безуспешные попытки обнаружить и выделить его в инфекционной форме из опухоли или из органов больных птиц находились в противоречии с данными о высокой контагиозности этого заболевания. В 1969 г. Calnek et al. выявили вирусспецифический ИФ АГ в эпителии перьевых фолликул зараженных цыплят. Оказалось, что перьевые фолликулы — постоянное место локализации АГ в высокой концентрации. Однако дерма и эпидермис кожи инфицированной птицы всегда свободны от вирусспецифического АГ. Пораженные клетки эпителия фолликулов, представляющие часть многослойного плоского эпителия, в результате слущивания отделяются в окружающую среду вместе с линяющими перьями и являются источником инфекции. В 1970 г. выделили из этого источника инфекционный внеклеточный вирус и вызвали с его помощью заболевание у цыплят. Эта работу продолжили Nazerian и Witter. Они вызвали заболевание внеклеточными экстрактами перьевых фолликулов и доказали, что местом репликации полного инфекционного вируса является эпителий перьевых фолликулов. Позднее для передачи инфекции использовали перхоть, собранную от инфицированных птиц.

Распространен повсеместно. Болеют куры, индейки, фазаны, утки, гуси, лебеди, канарейки, куропатки. Наиболее восприимчивы куры и особенно цыплята в первые 2 недели жизни. БМ известна очень давно, а истинный возбудитель ее — только с 1970 г. С открытием и описанием возбудителя БМ и герпеса индеек по иному представились пути передачи инфекции, иммунитет и перспективы специфической профилактики.

БМ получила свое название в 1961 г. в США на конференции Всемирной ветеринарной ассоциации птицеводства. До этого ее смешивали с лимфоидным лейкозом из-за сходства поражений в висцеральных органах. Чаще всего явные опухоли, состоящие почти исключительно из лимфоидных клеток, находили в печени и гонадах. В 1950 г. эта инфекция, еще точно не дифференцированная от лимфоидного лейкоза, сильно распространилась в США. Она наблюдалась у молодых птиц, проявляясь ярко выраженными висцеральными поражениями. В 1965 г. аналогичная болезнь появилась в Великобритании. До тех пор, пока не были предложены вакцины, фермеры не могли вести борьбу с болезнью, масштабы распространения которой все возрастали. БМ распространена по всему миру, но, в основном, в районах промышленного птицеводства, хотя стада птицы поражаются ею в разной степени. Заболевание под названием «нейролимфоматоз птиц» впервые зарегистрировано в России в 30—40-е гг. о чем сообщалось в работе А. В. Коронного (1941 г.). Возникшую тяжелую ситуацию по БМ в США, Великобритании и Европе охарактеризовали как эпизоотию. В это время было предложено название «острая форма БМ» в противоположность форме с доминирующими нервными изменениями, которая затем была обозначена как «классическая форма БМ». Острую форму БМ в СССР впервые установили в 1970 г. До применения средств специфической профилактики БМ наносила огромный экономический ущерб во всех странах мира.

Клинические признаки. БМ проявляется в возрасте от 6 недель, но чаще от 12 до 24 недель. Инкубационный период длится от 3—4 недель до нескольких месяцев. Смертность колеблется от единичных случаев до 70—80 %. При классической форме поражается небольшой процент стада (до 10), а при острой — 20—30 %. Среди птиц, оставленных для воспроизводства, болезнь особенно распространена у птиц тяжелых пород (белые рокки) и приводит к летальному исходу в среднем в 23,7 % случаев; были зарегистрированы случаи с летальностью, превышающей 50 %. В естественных условиях от БМ среди бройлеров наблюдается небольшая смертность, так как их убивают в 2-месячном возрасте. Смертность часто начинается в 8-недельном возрасте у несушек, хотя пик ее обычно наступает к 5 мес. При искусственном заражении суточных цыплят без материнских AT они могут погибнуть через 3 недели и даже через 10— 17 дней после периода депрессии и остановки роста.

При БМ наблюдаются три фазы: острая цитолитическая инфекция, латентная инфекция с иммуносупрессией и развитие опухолей. Во время латентной инфекции наблюдается супрессия Т-клеток. Очевидно иммуносупрессия происходит за счет ана-птоза Т-клеток СД4+ и нарушения транскрипции генов СД8+.

БМ протекает классически и остро. Первая характеризуется поражением нервов и развитием параличей, вторая — образованием множественных лимфоидных опухолей в висцеральных органах. Классическое течение проявляется обычно хромотой, парезами, атаксией, параличами одной или двух конечностей, крыльев, шеи и хвоста. С 1903 г. болезнь обычно называлась «птичьим параличом». Больная птица погибает от дегидратации и истощения. При классическом течении болезни выявляют невральную и окулярную формы, которые могут встречаться раздельно или в сочетании. Невральная форма протекает подостро и характеризуется двигательными расстройствами: беспорядочным перемещением, шаткой походкой, хромотой. В дальнейшем возникают парезы и параличи ног, крыльев, хвоста, шеи и зоба. Окулярная форма протекает хронически: заболевает птица чаще в 5—16 месячном возрасте. При некоторых вспышках в процесс вовлекается радужная оболочка глаза, которая становится бледной (белесой), зрачок имеет неправильное очертание и не реагирует на свет. Этот синдром называется «глазным лейкозом». Смертность при поражении глаз наблюдается редко, с признаками нервных явлений она составляет 2—5 %. При некоторых вспышках преобладают поражения кожи, называемые «кожным лейкозом».

Острое течение БМ проявляется внезапно, быстро, характеризуется массовыми «транзитными» параличами, внутренние органы поражаются лимфоидными опухолями. У больных птиц наблюдаются депрессия, атаксия, удушье. Перед гибелью развиваются параличи, дегидратация и истощение. В обследованных А. Ф. Федотовым птицеводческих хозяйствах при опухолевых болезнях кур на острое течение БМ приходится 51,6+1,4 %, налимфоидный лейкоз — 19,2+1,3 %. У вакцинированных цыплят в возрасте от 5,5 до 19 месяцев остро протекающая БМ составляет 30,6 %. Заболевание у птиц старших возрастных групп преимущественно связано с возрастным ослаблением иммунитета по разным причинам.

В Венгрии в течение 27 лет наблюдалось спорадическое появление классической (с поражением нервной системы) БМ, ни разу не выявили острое течение болезни с образованием опухолей. Можно заключить, что классическая и остро протекающая БМ вызываются двумя разновидностями вируса БМ. При этом речь идет о герпесви-русах, которые локализуются в разных органах. Но иногда и при классической БМ образуются опухоли, а поражения периферических нервов могут наблюдаться и при остром течении БМ. Герпесвирусы в зараженных стадах образуют почти апатогенные разновидности. Поэтому остро протекающая БМ у птиц старшего возраста сопровождается смертностью. В переболевших стадах птиц, включая потомство, развивается специфическая резистентность и, как результат, ослабляется течение болезни.

На возникновение и тяжесть течения БМ влияют по меньшей мере 7 факторов: 1) патогенность вируса — одни штаммы индуцируют образование опухолей, другие — нервную или классическую формы; 2) генетическая предрасположенность и возраст цыплят; 3) пол цыплят — курочки болеют чаще, чем петушки; 4) наличие материнских AT, которые снижают развитие виремии, но не предотвращают ее полностью. Снижение виремии зависит от количества материнских AT и степени их серологического родства с инфицирующим вирусом; 5) интерференция между штаммами. Инфицирование цыплят слабыми и апатогенными штаммами приводит к интерференции с реинфицирующим вирусом, в результате чего его высокая патогенность не проявляется; 6) заражение посторонними вирусами и другими агентами — вирусом ИББ, рео - и аденовирусами, из бактерий — сальмонеллами; дополнительный стресс-фактор — кокцидии; 7) состояние окружающей среды: качество кормов, вода, зооги-гиеничАСкие условия содержания (воздухообмен, световой режим и др.). Патологоанатомические и гистологические изменения. Еще в 1968 г. Eidson et al. изучили БМ, вызванную полевым вирусом YA, посредством контакта здоровых цыплят с зараженными птицами. Контактно заражали цыплят однодневного возраста, затем отдельными партиями с 1 до 8 нед их убивали с недельным интервалом. Исследовали на наличие макро - и микропоражений. Вирус БМ вызывает лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся клеточной инфильтрацией нервной системы, а также опухолями в паренхиматозных органах.

Заслуживают внимания изменения ЦНС. По данным Fletcher и других, в головном мозге появляются многоядерные клеточные периваскулярные инфильтрации, определяемые как негнойный диффузный энцефалит. Ранние изменения в ЦНС наступают к началу 2-й недели и особенно интенсивно на 4-, 5-, 6-, 7-й недели после заражения. Наблюдаются односторонние поражения белого вещества спинного мозга.

Нервы поражаются, в основном, при классическом течении БМ. Нервные волокна отечны, исчезает полосчатость, они становятся сероватыми. Иногда степень увеличения их различна, иногда поражения сопровождаются опухолями в гонадах. В головном и спинном мозге отмечают гиперемию сосудов и участки размягчения.

При остром течении БМ неопластический процесс характеризуется образованием лимфом в тканях и органах. Лимфомы могут поражать гонады, печень, легкие, мышцы, кожу, селезенку, почки, фабрициеву бурсу или тимус. Опухоли могу быть в виде фокусов, ограниченные или диффузные. Пораженный орган увеличен и бледен, так как инфильтруется лимфоидной опухолевой тканью. Обычно при этом происходит атрофия бурсы Фабрициуса, однако, когда она поражена опухолью, стенки и складки ее диффузно утолщаются. Установлены отличительные изменения в фабрициевой бурсе: фолликулы в атрофическом состоянии, нередко кистозного строения, межфолликулярная ткань инвазирована новообразованными клетками. В других органах — разные по обширности очагово-диффузные скопления лимфоидных клеток. При значительном поражении органов нормальная архитектоника их значительно нарушена. Лимфомы при БМ состоят преимущественно из малых, средних и больших лимфоцитов, одиночных гистиоцитов, плазматических клеток и гранулоцитов, реже встречается мономорфноклеточный состав лимфоидных опухолей.

В 20—30 % случаев встречают образование опухолей в яичниках и семенниках, которые увеличиваются в размерах, имеют бугристую поверхность и плотную консистенцию. При остром течении болезни трупы истощены, слизистые оболочки анемичны, редко отмечают поражение глаз. У птиц обнаруживают опухоли в сердце, легких, поджелудочной железе, тимусе, фабрициевой сумке, яичниках, семенниках, мышцах, коже и относительно редко — в периферических нервных стволах в виде диффузных или ограниченных образований. В процесс вовлекается один или несколько внутренних органов, а иногда опухолевые образования находят только в нервных стволах, что связывают с тропизмом штамма к различным тканям. Печень, селезенка, почки увеличены, с гладкой или бугристой поверхностью, усеяны диффузными или очаговыми узелками светло-серого цвета, придающими органам пестрый вид. В железистом желудке, на всем протяжении кишечника и брыжейки имеются серовато-белые узелки новообразованной ткани.

Иммуноморфологическим методом установлено, что при острой БМ лимфомы состоят преимущественно из популяций Т-лимфоцитов. В зависимости от локализации лимфы в различных органах содержание Т-лимфоцитов колеблется от 50,2+2,0 % до 94,5+2,8 %; В-лимфоцитов — от 3,5+0,65 до 31,0+1,97, а 0-лимфоцитов — от 1,5+0,49 % До 22,8+1,08%. Индекс митотической активности клеток лимфом при БМ достоверно выше (1,09+0,15 %), чем клеток интактной лимфоидной ткани (0,57+0,1 %).

В лимфомах обнаружено значительно больше патологических митозов (0,024±0,004 %). При экспериментальной инфекции через 3—4 недели после заражения образуются первые пролифераты (I фаза), преимущественно в яичниках, а также в печени, селезенке и других органах, локализуясь, в основном, около кровеносных сосудов. Патологические изменения при БМ иногда носят отчетливо выраженный воспалительный характер, а в других случаях — неопластический. У высокочувствительных цыплят, инфицированных после вылупления, при отсутствии материнских AT отмечаются изменения в виде дегенерации и некрозов, с появлением внутриядерных включений в тимусе, фабрициевой сумке, костном мозге, почках, печени, поджелудочной железе, преджелудке, селезенке, сердце. Изменения обнаруживаются в начале болезни и через 10—17 дней после заражения приводят цыплят к гибели. Вторая пролифера-тивная фаза характеризуется тем, что в процесс вовлекаются ретикулярные и лимфо-идные клетки, что ведет к гибели цыплят, начиная с 21-го дня до нескольких месяцев после заражения. Пролиферативные изменения сопровождаются иногда энцефало-миелитами.

Третья фаза болезни — это хроническое воспаление периферических нервов и поражения типа В. При исследовании 3 тыс. птиц разного возраста на наличие посмертных изменений в 294 пробах из различных органов были обнаружены изменения, характерные для БМ. При классической форме заболевания микроскопически обнаруживали утолщение и отек нервов. Особенно резкие изменения были отмечены в седалищном нерве и плечевом сплетении. Однако наиболее ранние поражения находили в бедренном нерве. При висцеральной или острой форме течения болезни изменения чаще наблюдали в печени, почках, селезенке, сердце и преджелудке.

При классическом течении болезни в головном и спинном мозге отмечают периваскулярные и перицеллюлярные отеки, пикноз нервных клеток, пролиферацию глиальных и лимфоидных элементов. В нервных стволах выявляют гиперемию сосудов, диапедезные кровоизлияния, отек и инфильтрацию интраневральной соединительной ткани лимфоидно-гистиоцитарными клетками разной степени зрелости. Лимфоидные инфильтраты обнаруживают в зрительных нервах, мышцах и оболочках глаз. При осложнении секундарной инфекцией выявляют фибринозное воспаление радужной оболочки, слезных желез и протоков. Часто в процесс вовлекаются семенники и яичники, где устанавливают образование лимфом из лимфоцитов, гистиоцитов и плазматических клеток. При исследовании внутренних органов, чаще поражающихся при остром течении болезни, устанавливают расстройство гемодинамики, дистрофию и некроз паренхимных клеток, пролиферацию и инфильтрацию лимфоидными, гистиоцитарными и плазматическими клетками периваскулярной соединительной ткани и постепенное вытеснение паренхимы. В случае поражения головного и спинного мозга обнаруживают изменения, соответствующие негнойному энцефалиту и миелиту. В периферических нервах вначале отмечают инфильтрацию нервных волокон лимфоидными, шванновскими клетками, в последующем наблюдают отек и лимфоидную инфильтрацию интраневральной соединительной ткани.

В зависимости от клеточного состава различают 3 типа лимфом: 1) лимфатические, состоящие из лимфоцитов, лимфобластов и пролимфоцитов, или они могут образовываться из лимфоцитов одного вида; 2) гистиоцитарно-плазматические, образованные из зрелых и незрелых гистиоцитов, ретикулярных и плазматических клеток; 3) смешанно-клеточные, состоящие из лимфоцитов, гистиоцитов и фибробластов разной степени зрелости.

У птиц чаще регистрируют смешанно-клеточные образования. У цыплят раньше других органов поражаются тимус, фабрициева сумка и кожа. В эпителии перьевых фолликулов обнаруживают внутриядерные и цитоплазматические включения, окрашивающиеся по Фольгену. Развитие БМ изучалось посредством исследования периферических нервов и других органов в различные сроки после заражения молодых кур шт. НРР В14 БМ. Было обнаружено 3 типа нервных поражений: тип А, характеризующийся пролиферацией лимфоидных клеток, иногда демиелинизацией и пролиферацией шванновских клеток; тип В, характеризующийся диффузной инфильтрацией малыми лимфоцитами, плазматическими клетками, отеками, иногда демиелинизацией и пролиферацией шванновских клеток; тип С, характеризующийся незначительной легкой инфильтрацией, плазматическими клетками и малыми лимфоцитами. Были также обнаружены поражения смешанного типа А и В.

Характерные для БМ поражения наблюдаются в нервах, где происходит инфильтрация лимфоидными клетками. Иногда поражения похожи на неврит. Лимфоидные опухоли висцеральных органов и кожи состоят преимущественно из трансформированных Т-лимфоцитов. Поражения печени заключаются в инфильтрации лимфоидными клетками, вокруг портальных вен. Эти инфильтраты увеличиваются, соединяются и в некоторых случаях большие области печени инфильтруются лимфоидной тканью. Обычно при этом повреждаются гепатоциты. Лимфоидной инфильтрации может подвергаться сердце и соматические мышцы, что вызывает дегенерацию и некроз мышечных волокон. Поражение кожи начинается с увеличения лимфоидных фокусов рядом с перьевыми фолликулами.

Патологические изменения фабрициевой бурсы при БМ характеризуются либо дегенерацией, либо пролиферацией лимфоидных органов. Дегенеративный процесс заключается в атрофии органа, образовании кист, очаговом некрозе. Пролиферативный процесс связан с обильной лимфоидной инфильтрацией. Наблюдается дегенерация эпителия, выстилающего перьевые фолликулы. Процесс прогрессирует до тех пор, пока базальная мембрана клеток не инфильтрируется массой лимфоцитов. При ЭМ пространство между оболочкой пера и эпителием перьевого фолликула заполнено детритом и большим количеством развивающихся вирусных частиц. У японских мелкопородистых кур, имеющих клинические, морфологические и микроскопические доказательства БМ, выявлен артериосклероз аорты и большой артерии, характеризующийся крайне утолщенной интимой и заметным замыканием просвета. Иммуноокрашивание пролиферирующего клеточного ядерного АГ выявило много меченых ядер в утолщенной интиме и реже вне ядра.

Патогенез. Схематически представляется следующим образом. Вирус с лейкоцитами крови проникает во внутренние органы и размножается в клетках лимфоидной ткани фабрициевой сумки, тимуса, селезенки, в местах лимфоидной инфильтрации органов и нервных стволов. В лимфоидных органах отмечают некроз лимфоцитов и гиперплазию ретикулярных и эпителиальных клеток. Вследствие гибели лимфоцитов нарушается нормальное функционирование иммунной системы, что способствует генерализации инфекции и образованию опухолей во многих органах. В клетках лимфоидных органов, а также в эпителии почек, надпочечников, поджелудочной железы наблюдали репликацию вируса, где он находится в тесной ассоциации с клеткой и выявляется в виде внутриядерных и цитоплазматических включений. И только в перьевых фолликулах вирус, размножаясь в эпителиальных клетках герменативного слоя, созревает и выделяется в виде свободных вирионов.

В данном случае рассматривается патогенез БМ у цыплят, вызванный вирусом БМ и вирусом герпеса индеек, а также патогенез герпетической инфекции у индюшат, вызванной естественным возбудителем — вирусом герпеса индеек и гетерологичным — вирусом БМ.

Влияние вируса на кровь и кроветворные органы. У экспериментально зараженных цыплят инфекция достигает пика на 2-й неделе, когда накапливается вирусный АГ и в тканях присутствует клеточно-связанный вирус. Затем виремия постепенно затухает, но поддерживается вплоть до гибели птицы. При исследовании крови (с недельным интервалом) цыплят, зараженных в суточном возрасте вирусом БМ, отмечено снижение количества эритроцитов и уменьшение их размеров, т. е. вирус БМ вызывал анемичное состояние.

Имеются сообщения о влиянии вируса БМ на кроветворные органы. Отмечены деструктивные поражения фабрициевой сумки и тимуса у цыплят, зараженных вирусом БМ. Причину предположительно объясняют так: возбудитель стимулирует стержневые клетки производить лимфоциты (как при лейкемиях). Второе мнение — данный вирус влияет на кроветворные органы, вызывая не только их деструкцию, но также интерферирует с кроветворением, что приводит к задержке и снижению синтеза новых эритроцитов; анемия проявляется раньше появления поражений в кроветворных органах.

Цитолитические изменения лимфоидных органах — критерий патогенности штамма и одна из возможных причин иммуносупрессивного действия вируса.

Влияние селезенки на патогенез БМ. Селезенка влияет на ранний патогенез БМ. Внутренний вирусный АГ в бурсе и тимусе обнаруживали на 2-3 дня раньше у интакт-ных птиц, чем у спленэктомированных. Но селезенка не предотвращает инфицирования других органов. У цыплят после спленэктомии инфицированные лимфоциты выявлялись в тимусе, бурсе через 6—7 дней после интратрахеального заражения вирусом БМ. Спленэктомия не предотвращает образование AT против БМ.

Селезенка является важным органом для начала репликации и распространения болезни Марека (MDV). Исследовалось распределение лимфоцитов внутри селезеночной ткани онкогенной линии цыплят 6i и в чувствительной линии После заражения ВБМ. Использовался метод двухцветного непрямого иммуногистологического окрашивания. Показана полупродуктивная инфекция лимфоцитов при использовании антител, идентифицирующих специфический для MDV фосфопротеин рр38. Лимфоциты, содержащие рр38, были более многочисленны и определялись раньше в линии (главным образом В-лимфоциты). В линии 6i ранняя инфекция была связана с истощением В-зависимых областей, в линии Эта область была крайне истощена. Оставшиеся В-лимфоциты присутствовали в диффузных агрегатах, смешанных с другими видами лимфоцитов (CD8+, CD4+ и TCRa/3+).

Сделано заключение о большей репликации и распространении ВБМ в селезенке линии /г - Поскольку Т-клетки являются главной мишенью для трансформации, иммунные реакции в линии Могут способствовать увеличению случаев неоплазии. Сравнивали иммуноцитохимически изменения в распределении лимфоцитов в селезенке зараженных вирусом болезни Марека (ВБМ) белых леггорнов линии (восприимчивы к ВБМ) и 6i (устойчивы к ВБМ). Лимфоциты (преимущественно В-клетки), экспрессирующие антиген рр38 ВБМ, выявлялись через 4—6 дней после заражения, но не более 8 дней. Количество их было больше в линии 1г. В линии 6i инфекция сопровождалась истощением В-лимфоцитов и повышением числа Т-лимфоцитов через 3—6 дней после заражения, без изменения соотношения этих клеток. Через 8 дней начинали восстанавливаться В-клетки, а количество Т-клеток уменьшалось. В линии 1 г инфекция вызывала изменение в распределении лимфоцитов с формированием «лимфоидных поражений». Диффузные нерегулярные бляшки В-лимфоцитов окружали капилляры и начинали окружаться крупными агрегатами лимфоцитов TCRaJ ]+СШ* и CD4+, ограниченных полосой лимфоцитов TCRyS*1». С 8-го дня после заражения зависящее от В-клеток поле частично восстанавливалось, тогда как лимфоциты TCRa/3 1CD4+ и CD8+, потенциально трансформированные, становились интенсивно рассеянными по селезенке. Таким образом у цыплят линии Репликация и распространение ВБМ более эффективно, а ранний ответ Т-клеток — выше, что способствует более активному развитию опухолевой стадии заболевания.

Влияние фабрициевой бурсы на течение БМ. Недавно было обнаружено, что бурсо-эктомия, проведенная у 17-дневных эмбрионов, повышает резистентность цыплят к заражению их вирусом БМ или трансплантации опухолевых клеток. У бурсоэктоми-рованных цыплят на 4-, 7-, 11-й день после инокуляции им онкогенного вируса БМ (шт. А-5) отсутствовали внутренние вирусные антигены в тимусе и селезенке. У ин-тактных же цыплят после инокуляции им этого вируса на 4-й день выявляли внутренние вирусные АГ и на 7-, 11-й день — некроз селезенки у бурсоэктомированных цыплят был более низкий уровень виремии по сравнению с интактными. Между 2- и 6-й неделей после инокуляции шт. А-5 БМ интактные цыплята погибали с массивными лимфомами, а бурсоэктомированные цыплята не заболевали, т. е. у бурсоэктомированных цыплят клеточный иммунитет сохранялся. Куры, зараженные патогенным шт. ВБМ после хирургического удаления у них в однодневном возрасте фабрициевой сумки, оказались неспособными продуцировать антитела на убитую культуру S. pullo-rum, хотя в распространении поражений после заражения ВБМ заметных реакций не обнаружено.

Изучен механизм иммуносупрессии при латентной инфекции БМ с помощью критерия аноптоза мононуклеарных клеток периферической крови у цыплят. После ранней литической стадии ВБМ индуцирует лимфомы Т-клеток, которые латентно инфицируются ВБМ и почти не продуцируют белки и транскрипты ВБМ. Главную роль в вызываемом ВБМ онкогенезе играет белок meg. Для латентности и трансформации нужен также белок 1СР4. Кроме кодируемых ВБМ белков в индукции опухолей участвуют различные клеточные функции. Возможна роль опухолевого супрес-сорного белка р53, блокирующего аноптоз протоонкогена Вс1-2 и полимераз в индукции лимфом.

Описаны 3 типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивная (полупродуктивная) инфекция, латентная (непродуктивная) инфекция и онкогенная трансформация, которые по предложению Calnek, определяются различными клетками-мишенями, вовлеченными в инфекционный процесс. Так, продуктивная инфекция выявлена только в эпителии перьевых фолликулов (ЭПФ), где ВБМ, репродуцируясь, завершает цикл развития и выделяется в виде зрелых вирионов, не связанных с клеточной структурой. Полупродуктивную инфекцию, вызывающую гибель (цитолиз) клеток, обнаруживают в лимфоидных органах, эпителиальных клетках и крайне редко в опухолях. Основными клетками-мишенями для данного типа взаимодействия вируса с клеткой являются В-лимфоциты. Инфекция характеризуется тем, что вирусные частицы, пройдя полный цикл морфогенеза, не освобождаются из клетки, а находятся с ней в тесной связи. Клетки, подверженные этому типу инфекции, продуцируют вирусные АГ и могут быть идентифицированы ИФ и ИФА. Полупродуктивная инфекция протекает однотипно in vitro и in vivo. ВБА может персистировать в лимфоцитах пожизненно. В случае цитолитической инфекции поражаются сначала В-клетки, затем — Т-клетки, после чего возникает латентная инфекция и возникают гетерогенные опухоли лимфоидной системы в периферических тканях.

Изучали опухоли, вызванные ВБМ ex vivo, определяя иммунофенотип, добавочные молекулы и экспрессию внутренних антигенов вируса. Эти изменения коррелировали с клеточным циклом и фрагментацией ДНК. Основная часть клеток в опухолях принадлежала к Т-клеткам CD4+ и экспрессировала вариабельную пропорцию нового кодируемого хозяином поверхностного антигена, узнаваемого МКА AV37. Меньшая часть опухолевых клеток состояла из клеток CD8+, yS TCR+ или В-клеток. В популяции клеток AV37+ и CD4+ выявлялось немного клеток с фрагментированной ДНК. Присутствующие небольшие количества CD8+, ^TCR+ и В-клеток содержали фрагментированную ДНК в высокой пропорции. Все опухолевые клетки экспресси-ровали основной белок лейциновой застежки, Meq, но немногие клетки экспресси-ровали другие белки ВБМ, связанные с продуктивной инфекцией. Экспрессия Meq была тесно связана с экспрессией поверхностного антигена AV37. Добавочные молекулы, экспрессируемые на AV37, были типичны для активированных клеток CD4+ с исключением костимулирующей молекулы CD28, которая отсутствовала или была понижена. Считают, что механизм опухолеобразования определяется запрограммированной гибелью клеток CD8+ и фенотипов эффектора TCR+, а также пониженной регуляцией клеток CD28 и AV37+.

Поскольку латентно инфицированные клетки не продуцируют ВБМ, определить их очень трудно — только после сокультивирования с чувствительными клетками. Основными клетками-мишенями для латентной инфекции являются 1а-несущие Т-клетки (Т-хелперы и Т-супрессоры). Т-лимфоциты цыплят вовлекаются в латентное инфицирование ВБМ только после полупродуктивного заражения В-клеток. На трансформированных клетках находят опухолеспецифический АГ MATSA.

Таким образом, патогенез БМ на клеточном уровне представляется следующим образом. ВБМ вызывает раннее инфицирование В-лимфоцитов, которые являются главными клетками-мишенями для полупродуктивной инфекции, затем активируются Т-клетки через макрофаги и Т-хелперы (помощники), распознающие одну детерминанту антигена, обеспечивая тем самым подачу антигенного сигнала В-лимфоци-ту, распознающему другую детерминанту того же антигена. Происходит Т-В-коопера-ция с участием макрофага. Инфицированные Т-клетки трансформируются. Причем, в трансформированных клетках, как правило, не обнаруживают вирусных ДНК.

Учитывая то, что вирус передается контактным путем, патогенез БМ на уровне организма можно разделить на ряд последовательных этапов. Первоначально инфицируется респираторный тракт (после ингаляции ВБМ). На 3—4-й день после инфекции возникает первая (ранняя) цитолитическая фаза ведущая к деструкции лимфоидной ткани (временная иммунодепрессия). За 1-й цитолитической фазой следует латентный период, когда ВА не обнаруживается. В зависимости от различных факторов инфекция либо не развивается, либо развивается 2-я цитолитическая фаза, сопровождающаяся длительной иммуносупрессией, инфильтрацией трансформированными Т-лимфоцитами нормальных тканей, периферических нервов и висцеральных органов. Одновременно происходит распространение вируса по всему организму зараженными лейкоцитами.

Особенностью БМ является иммуносупрессия (ослабление иммунного ответа). Иммуносупрессия приводит к повышенной предрасположенности к инфекционным заболеваниям и возникновению Т-клеточных лимформ. Тимусзависимая лимфоид-ная система играет при БМ двоякую роль: у чувствительных особей является мишенью для вируса, а у резистентных — обусловливает клеточный иммунный ответ на трансформированные вирусом клетки. Степень развития иммуносупрессии зависит от множества факторов, перечисленных выше, но в большей мере от генетических особенностей организма хозяина. К проявлению генетической резистентности при-частны два различных генетических локуса: связанный и не связанный с главным комплексом гистосовместимости (ГСК). Резистентность, отнесенная к ГКС, ассоциирована с локусом гена, ответственного за группу крови (группа крови В), а именно с В 21-аллелем эритроцитов. Этот аллель, определяемый по анализу крови, широко распространен среди популяций птицы. Причем установлено, что устойчивые (N-ли-ния) и чувствительные птицы (Р-линия) не различаются по степени инфицированно-сти ВБМ в период ранней цитолитической фазы патогенеза, но они резко различаются по интенсивности развития лимфом.

Недавно Calnek предположил, что генетическая резистентность, связанная с ГСК, проявляется на стадии превращения активированных Т-лимфоцитов в бласты, которые являются основными клетками-мишенями для злокачественного перерождения под влиянием ВБМ. Чем их больше, как это отмечено у чувствительных особей, тем больше клеток-мишеней для инфицирования и малигнизации, тем тяжелее иммуносупрессия. БМ относится к заболеваниям, при которых выявлена генетическая предрасположенность к резистентности или восприимчивости.

На патогенез БМ влияют четыре фактора: Таких факторов 4: 1) материнские AT, которые интерферируют с заражением и ранним распространением вируса, подавляют острую цитологическую инфекцию в лимфоидной ткани; 2) генетическая конституция — у цыплят резистентных пород виремия и уровень вируса в тканях ниже, чем у чувствительных. У резистентных животных лимфопролиферативные поражения не развиваются. Генетическая резистентность может быть связана с возрастной; 3) возрастная резистентность, когда снижается уровень виремии и повышается уровень ВНА; 4) патогенность вируса. Некоторые шт. ВБМ при инокуляции чувствительным цыплятам вызывают острое течение БМ, другие — классическую, третьи — вообще не вызывают клинической болезни. Так, из лейкоцитов крови здоровых (невакциниро-ванных) кур-несушек, имеющих AT к ВБМ, выделены полевые штаммы ВБМ VTJB-М и VUB-K. После адаптации вируса штаммы приобрели цитопатогенную активность в отношении к ФЭК. При изучении двух онкогенных и двух неонкогенных шт. ВБМ, были получены сходные характеристики по их локализации в органах птицы. Неонкогенные варианты ВБМ резко снижали репликативную способность лимфоид-ных органов, не вызывали гистопатологические изменения в селезенке и образование опухолей. Экспериментально ослабленный ВБМ утрачивал онкогенные свойства, но защищал цыплят, зараженных затем вирулентным ВБМ. Аттенуированные, но не природноослабленные шт. ВБМ не созревают в эпителии перьевых фолликулов. Возможно, этим объясняется их неспособность передаваться контактно от вакцинированной к невакцинированной птице. БМ относится к болезням, при которых выявлена генетическая предрасположенность к резистентности или восприимчивости.

По наличию специфических поражений установлена различная чувствительность к этому вирусу БМ трех генетических линий кур: А — 22,8 %, В — 79,6, С — 51,8 %. В 1989 г. в Сенегале наблюдали различные клинические проявления БМ в зависимости от породы. Так, у пород с коричневой окраской болезнь протекала классически с гипертрофией нервных стволов. У кур породы белый леггорн наблюдалось атипичное течение болезни с поражением гребня (инфильтрация и некроз), атрофией грудных мышц, дегенерацией яичников и лимфоцитарной инфильтрацией органов, особенно фолликулов перьев и нервных стволов.

Резистентность кур к БМ бывает двух типов. Первый тип определяется аллелями крови группы В, в особенности аллелями В21, которые ответственны за повышение потенциала иммунной защиты и возрастную резистентность. Второй тип резистентности связан с повышением резистентности лимфоидных клеток к вирусной инфекции и трансформации и контролируется аллелями Т-1, HOI, у-4. Установлен факт влияния основного комплекса гистосовместимости на резистентность цыплят к БМ.

При селекции кур, резистентных к этой болезни, наиболее эффективно в качестве маркера проводить идентификацию гаплотипов В МНС (тканевой гистосовместимости). Гибридные цыплята белый леггорн генетически паралич резистентны (линия В1), имеют генотип В|2В13 главного комплекса гистосовместимости, а цыплята линии В2 (генотип В6В6) паралич-чувствительны. В иммунологически индуцированной резистентности главную роль играет антивирусный Т-клеточно-ассоциированный иммунитет.

Морфология И Химический состав. Вирионы имеют кубический тип симметрии и форму икосаэдра. Вирус содержит 7 % двухнитевой ДНК. В ультратонких срезах культур зараженных клеток вирусные частицы под электронным микроскопом имеют диаметр 85—100 нм, но иногда встречаются более крупные вирионы с оболочкой размером 150—170 нм. Они могут содержать электронноплотный нуклеоид и располагаться большей частью в ядре. Различия в размерах комплексов обусловлено различием в углеводном компоненте. В отличие от развивающихся вирусных частиц, которые образуются в культуре клеток, вирусные частицы в клетках эпителия перьевых фолликулов являются осмиофильными включениями в цитоплазме клеток и состоят из электронноплотного материала. Число капсомеров 162, они представляют собой полые цилиндры длиной 9—12 нм. Кольцеобразный нуклеокапсид с подковообразной сердцевиной расположен между двумя частицами, сердцевина нуклеокапсида с палочкообразными структурами представлена двумя круглыми пересекающимися пластинками, края которых электронноплотные, а центр светлый. Морфогенез ВБМ в клетках перьевых фолликулов описаны И. П. Тыщенко.

Геном ВБМ представлен двумя уникальными последовательностями (Ui и Us) и целым набором прямых и инвертированных повторов. Секвенирован сегмент ДНК Длиной 11286 п. н. вирулентного шт. СА ВБМ, содержащий всю область Us длиной 11160 п. н. Идентифицированы 11 открытых рамок считывания (ОРС), 7 из которых гомологичны генам альфагерпесвирусов (АГВ). Область Us шт. GA на 99 % идентична ранее секвентированному сегменту (5255 п. н.) Us очень вирулентного шт. RBIB ВБМ. Полученные данные согласуются с предположением, что ВБМ относится к АГВ, а не к гамма-герпесвирусам. С использованием полиаденилированной РНК Из стабильно трансформированной ВБМ линии клеток МКТ-1 сконструирована библиотека кДНК и выделены кДНК, специфичные для области короткого внутреннего повтора фрагмента BamHl-A генома ВБМ. Секвенирование 5"- И З'-концов выделенных клонов позволило идентифицировать четыре класса кДНК. Секвенирование и картирование этих кДНК обнаружило семейство Зч-котерминальных перекрывающихся транскриптов; некоторые из них сильно сплайсированы. Методом ПЦР амп-лифицированы специфические области каждого класса кДНК, клонированы и использованы для получения рибозондов, которые гибридизируются с различными транскриптами во фракциях РНК, выделенных из литически или латентно инфицированных ВБМ клеток.

Изучены нуклеотидные последовательности генов тимидинкиназы двух герпесвирусов птиц: высокоонкогенного шт. БМ-RBJB и вакцинного — герпеса индеек FC-126. Кодирующие регионы представлены в двух генах 1029 и 1050 нуклеотидными последовательностями, что соответствовало полипептидам с 343 и 350 остатками аминокислот.

С помощью ПЦР из генома ВБМ были амплифицированы и клонированы ген gA, кодирующий предшественник секретируемого гликопротеина gp57—65 (А-АГ) и ген gB, кодирующий белок-предшественник гликопротеинового комплекса gprof), gp60, gp48 (В-АГ). Установлена нуклеотидная последовательность обоих генов, предсказана и проанализирована первичная структура белков, кодируемых этими генами.

Секвенирован участок длиной 6593 п. н. уникальной длинной области генома вируса болезни Марека типа 2, расположенный в правой части ВатШ-фрагмента М2 и смежной части фрагмента К. Идентифицированы пять открытых рамок считывания, которые кодируют белки, гомологичные продуктам генов UL53 (гликопротеин К), UL54 (предранний белок ICP27) и UL55 вируса простого герпеса типа 1. Гомолог гена UL56 не обнаружен. Между генами UL54 и UL55 у вируса болезни Марека найден ген, гомологичный ORF-1 герпесвируса лошадей типа 1 и соответствующему гену вируса псевдобешенства. Две смежные открытые рамки считывания в фрагменте Bamffl-K (ORF873S и ORF873) имеют свойства интрона, кодирующего белок. ORF873S кодирует белок длиной 84 остатка с учетом гидрофобной сигнальной последовательности на С-конце, а ОКР873-белок длиной 873 остатка с трансмембранным доменом и 3 сайтами N-гликозилирования. В зараженных клетках все указанные гены транскрибируются с образованием З'-котерминальных транскриптов и/или уникального транскрипта. мРНК 3,5 т. н. ORF873 и ORF873S транскрибируется с промотора ORF873s. Идентифицированы донорный и акцепторный сайты, используемые для сплайсинга мРНК после вырезания интрона длиной 113 н.

Определили последовательность ДНК уникального протяженного (UL) участка и повторяющегося протяженного (RL) участка в геноме серотипа I GA вида ВБМ, представителя ?-герпесвирусов. Полный геном GA-MDV составляет около 174 т. п.н. и имеет организацию: TRL-UL-IRL-IPS-US-TRS. UL последовательность содержит 113 508 п. н. с 41,7 % GC-составом. 67 открытых рамок считывания (ORF) нашли в UL участке, 55 из которых гомологичны генам, кодируемым вирусом простого герпеса 1. 12 из 67 рамок считывания уникальны и их функции неизвестны. Все ORF, кодируемые RL, специфичны для серотипа I MDV. Эти ORF способствуют некоторым уникальным биологическим качествам MDV. Такими уникальными MDV-специфич-ными белками являются Meq, представитель семейства jun/fos, интерлейкин 8, СХС-хемокин, рр38, рр32, два фосфопротеина с неизвестными функциями, а также продукт гена липазы (LORF2), который гомологичен белкам из HPRS-24 (серотип II) ВБМ и различным аденовирусам птиц. Дополнительный признак MDV — это наличие остатков длинных концевых повторов вируса ретикулоэндотелиоза птиц, а именно энхансерного участка U3.

Изучение генома ВБМ серотипа 2 важно для понимания неонкогенной природы вируса. Был изучен короткий уникальный участок Us и секвенированы фрагменты F, Ml и R. Участок Us имеет в длину 12109 п. о. и содержит 12 ORF, кодирующих белки. семь из них гомологичны вирусу герпеса простого 1. Эти ORF консервативны. Аминокислотная последовательность MDV-2 гомологична серотипам ВБМ-1, ВГИ и вирусу ИЛТ. четыре ORF вблизи Us не имеют отношения к любым другим известным генам герпесвируса. Десять из 12 ORF Us-участка ВБМ-2 экспрессировались и транскрибировались с З'-концевыми транскриптами и/или с уникальным транскриптом в вирусинфицированных клетках. Белки, кодируемые Us ВБМ-2 были на 46—70 % и 33—59 % идентичными с эквивалентом ВБМ 1 и ВГИ соответственно.

Устойчивость, хранение и консервирование вируса. Устойчивость клеточно-свобод-ного вируса к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50 тыс. мин-1 осаждает вирус в течение 1 ч. В пределах рН 4—10 вирус чувствителен к эфиру. Многие месяцы он сохраняет вирулентность при -65 °С, но при -20 °С вирулентность его снижается через 4 месяца хранения. В чешуйках кожи (перхоти) и размельченных сухих перьях больных птиц, хранившихся в условиях 28,5 — 4!,5 °С вирус, активен в течение 55 дней. При контакте с этим вируссодержащим материалом у 40 % здоровых цыплят уже через 8 недель, обнаруживались гистологические изменения, свойственные БМ. Следовательно, чешуйки кожи (перхоть) и сухие перья больных птиц могут быть источником инфекции в птицеводческих фермах.

Schudel и другие успешно заражали цыплят суспензией кожи кур, павших от БМ. Пыль, собранная в помещении, где содержались больные цыплята, сохраняла инфек-ционность в условиях комнатной температуры не менее 44 дней. Клеточно-свобод-ный вирус, содержащийся в пыли курятника, патогенен для культуры клеток почек цыпленка и способен индуцировать опухоли в течение 1 года, Клеточно-свободный, экстрагированный из пыли вирус остается патогенным при хранении в условиях -70 °С, однако при -20 °С 60 % его инактивируется через 20 дней, а в условиях комнатной температуры — в течение 5 дней. Вирус выдерживает неоднократное замораживание, оттаивание и воздействие ультразвука в течение 10 мин. Полная термоинактивация клеточно-свободного вируса происходит при 4 °С через 2 недели, при 20—25 °С — через 4 дня, при 37 "С — через 18 чипри60°С —за 10 мин. Птичий помет сохраняет ин-фекционность в течение 16 недель.

Вирус сохраняется в клетках опухоли и культуры ткани при концентрации 50— 106 кл./мл в контейнере, погруженном в жидкий азот. Кожу и эпителий перьевых фолликулов, содержащих клеточно-свободный вирус, сохраняют при температуре -20—60 Или лиофилизируют. Кровь больных цыплят при хранении в условиях 4 "С остается вирулентной в течение 7 дней. При лиофилизации вируссодержащей крови ее патоген-ность падает. Надежное сохранение патогенных свойств вируссодержащей крови обеспечивается при добавлении к ней 5 %-ного ДМСО в жидком азоте (-196 °С).

АГ структура. Основными гликопротеинами ВБМ являются А - АГ - (gp57—65) и В-АГ- комплекс (gplOO, gp60 и gp49). В составе вируса БМ выявлено шесть АГ, из которых наиболее важные А, В, С. АГ А содержится во всех патогенных штаммах и при ат-тенуации утрачивается ими. АГ ВБМ содержит секретируемый гликопротеин с мол. м. от 57 до 65 кД в полностью гликозилированной форме. Этот АГ обнаружен в культу-ральной жидкости и экстрактах зараженных клеток, а В и С АГ — только в экстрактах зараженных клеток. Известно, что первоначально предшественник gA синтезируется как белок с мол. м. 47 кД, который после отщепления сигнального пептида дает белок-предшественник с мол. м. 44 кД. Функция gA до сих пор неясна. Он не является существенным для репликации в культуре клеток, но может иметь важное значение для развития вируса в организме птицы.

Выдвинута гипотеза о том, что gA является иммуносупрессором на ранних стадиях инфекции. АГ В представляет собой связанный с поверхностной мембраной комплекс, состоящий из трех гликопротеинов — gplOO, gp60, gp48, причем последние два представляют собой части первого. Полагают, что В -АГ - комплекс играет центральную роль в нейтрализации вируса иммунной системой хозяина и может вызвать частичную защиту против БМ. Помимо АГ А, В и С, ВБМ содержит мембранный АГ (связанный с клеточной мембраной), общий для ВБМ и ВГИ. Его обнаруживают в ИФ на поверхности клетки. Полагают, что мембранный АГ связан с А АГ, так как оба они исчезают при аттенуации вируса. АГ В также общий для ВБМ и ВГИ и выявляется в РДП.

Метод ИФ, в котором использовали сыворотки от переболевших или гиперимму-низированных птиц, оказался недостаточным, чтобы показать наличие АГ в опухолевых клетках. Однако аналогичная методика, в которой используют AT, полученные от цыплят или кроликов, иммунизированных трансплантатом опухолевых клеток, позволяет выявить наличие специфического АГ на поверхности опухолевых клеток. Этот АГ получил название опухоле-ассоциированного поверхностного АГ (MATSA). Он обнаруживается в большинстве опухолевых клеток, трансплантируемых опухолях и трансформируемых клеточных линиях, но его нет в культуре фибробластов, инфицированной ВБМ либо ВГИ. В опытах J. M. Sharm (183) большинство клеток-носителей MATSA осаждалось со скоростью, превышающей 3 мм/ч, тогда как клетки, осаждающиеся при более низкой скорости, не содержали этот АГ. Клетки-носители MATSA составляли 11,7 % клеток опухоли. Инфекционны были и клетки-носители опухолевого АГ и клетки, лишенные его. Таким образом, клетки, содержащие вирусный геном, необязательно являются носителями MATSA и не всегда трансформируются.

В 1972 г. Biggs сообщили о выделении в птицехозяйстве непатогенного (неонко-генного) штамма. ВБМ от здоровых цыплят и впервые предложили разделить имеющиеся изоляты на 3 родственные группы. К 1-й были отнесены вирусы, вызывающие острую БМ, ко 2-й — классическую, а к 3-й — апатогенные изоляты. Разделение вирусов на группы по патогенности совпало с серологической их классификацией, основанной на РИФ и РДП, с помощью которых Bulow и другие определили три серотипа. Серотип 1 включает все онкогенные вирусы и аттенуированные варианты, серотип 2 — все неонкогенные вирусы, серотип 3 — АГ родственные ВБМ вирусы герпеса индеек. Наличие трех серотипов в дальнейшем подтверждено РН вирусов, двумерным гель-электрофорезом и РИФ с применением монАТ. Серологическая классификация подтверждена сравнительными исследованиями фрагментов вирусных ДНК при обработке нуклеиновых кислот рестриктазами.

Вирусы серотипа 1 включают штаммы ВБМ, различающиеся по патогенности (онкогенности) для птиц. Высоковирулентные изоляты М.5, Ala-8, RB-IB выделены от цыплят вакцинированного поголовья во время вспышки БМ. Эти вирусы вызывают значительный отход при БМ у генетически резистентной невакцинированной птицы или у генетически чувствительной вакцинированной ВГИ птицы. R. Witter предложил называть очень вирулентными штаммы ВБМ (ОВВБМ), которые вызывают, характерные поражения в стадах птиц, длительное время вакцинированных препаратами на основе ВГИ. Вирулентные шт. серотипа 1 (GA, HPRS-16, JM) — вызывают значительный отход с коротким инкубационным периодом у генетически чувствительной, но не резистентной птицы. Умеренно патогенные классические шт. HPRS-17, Сопп-1 индуцируют опухоли только у незначительной части цыплят. Они имеют тенденцию вызывать нервные явления. Наименьшую онкогенность среди штаммов серотипа 1 имеют штаммы, подобные Си-1 или CVI988, которые вызывают только нервные изменения. Вирусы серотипа 2 изолируются довольно часто. По-видимому, они неонкогенны и непатогенны для цыплят. Вирусы серотипа 3 включают апатогенные, неонкогенные вирусы герпеса, выделенные от индеек. Впервые ВГИ выделили в США Witter et al. и Kawamura et al. при исследовании индеек как возможного промежуточного хозяина и резервуара вируса БМ в природе. ВГИ широко распространен в коммерческих индюшиных стадах.

Серотипы ВБМ характеризуются сложной АГ структурой, изучение которой важно для дифференциации штаммов, выявления значения отдельных вирусспецифиче-ских (оболочечных антигенов) и вирусиндуцированных (гА) белков в иммунитете при БМ, проведения серологических исследований, интерпретации АГ родства ВГИ и ВБМ, а также для конструирования эффективных вакцин. Высокоспецифичным и чувствительным экспресс-методом, с помощью которого возможно изучение перечисленных вопросов, является ИФА. Решением Международного эпизоотического бюро ИФА признан официальным референс тестом. В Российской Федерации впервые разработаны методы ИФА индикации антигенов разных серотипов ВБМ и AT к ним. В общем гликопротеидном АГ (гА), индуцированном ВГИ, содержатся две АГ детерминанты, одна из которых перекрестно реагирует со структурными компонентами вирулентных штаммов ВБМ, не имеет общих АГ связей с мелкофокусным вариантом ВГИ и аттенуированным ВБМ. Помимо теоретического, это открытие имеет и прикладное значение и побуждает пересмотреть существующее представление о роли отдельных АГ детерминант общего гликопроте-идного А АГ ВГИ и ВБМ.

АГ вариабельность и родство. Благодаря общему А-АГ различий в АГ характеристике штаммов данного вируса нет. Однако вирусы болезни Марека и герпеса индеек имеют АГ различия. Такое различие было показано при использовании РИФ, преципитации с двойной диффузией в агаровом геле и РН. Так, в клетках, инфицированных ВГИ, АГ выявляется с помощью гомологичной сыворотки и в ядре, и в цитоплазме, тогда как в клетках, инфицированных ВБМ, он выявлялся антисывороткой к ВБМ только в ядре. Аналогичные результаты были получены С. В Лавровым и др. При заражении культуры клеток куриных фибробластов ВГИ (шт. М-24) через 24 и 48 ч после заражения наблюдалась флюоресценция ядра и цитоплазмы. Свечение ядер было диффузным, в цитоплазме были видны тонкогранулярные глыбчатые светящиеся участки. Однако попытки продемонстрировать перекрестную РДП ВГИ и ВБМ оказались неудачными. Поскольку ВБМ является клеточно-ассоциированным, постановка РН с ним затруднена.

Nazarian и др. ЭМ охарактеризовали ультраструктуру вирионов ВГИ, которая оказалась чрезвычайно сходной с вирионом ВБМ. Герпесвирусы голубей, сов, соколов, больших бакланов, человека (типов 1 и 2), вирусы болезни Ауески и инфекционного ларинготрахеита не имеют серологического и иммунологического родства с ВБМ. По А-АГ ВБМ и ВГИ родственны, но не идентичны. Референтные шт. вируса JM, HPRS-24, Fc-126 относятся к серотипам 1 и 2 и 3.

Патогенные и онкогенные свойства. Тяжесть острой цитолитической инфекции БМ зависит от штамма вируса, например, шт. Md-5 и Md-11 оказались сходными с про-тотипным штаммом БМ по онкогенности для чувствительных цыплят, иммуноде-прессивной активности и антигенности. Другие же штаммы (JM/102 и JA-22) с большой частотой индуцировали острую цитолитическую инфекцию с атрофией бурсы и тимуса и ранней гибелью цыплят без развития лимфом, высокую онкогенность как для привитых ВГИ, так и непривитых (табл. 16.2).

В 1972 г. описаны изоляты ВБМ различной патогенности. Они впервые разделены на три категории: 1-я — вызывают остропротекающую БМ; 2-я — вызывают классическое течение болезни; к 3-й относятся авирулентные изоляты. Высоковирулентные изоляты обычно встречались в 3 раза чаще в неблагополучных фермах, а авирулентные — у птиц из благополучных хозяйств. Так, изоляты Е-107/81 и Е-129/81 более вирулентны, чем вариант МД-S.

В Северной Италии выделено два высоковирулентных изолята вируса, обладающих иммунодепрессивным эффектом. Наиболее восприимчивы цыплята в первые 2 недели жизни. Петухи породы корниш более устойчивы к БМ и восприимчивее к лимфоидному лейкозу, а несушки породы белый плимутрок — наоборот. Относительная частота обнаружения вируса БМ в определенной популяции кур обратно пропорциональна его вирулентности. С увеличением возраста птиц наличие менее патогенных вирусов возрастает. Иногда из одного и того же стада выделяли вирусы двух типов. Следовательно, один и тот же цыпленок в полевых условиях может быть заражен вирусами более, чем одного типа. В 1972 г. Cho и Септу решили проверить эту мысль, вызывая двойное заражение острым и слабым штаммами ВБМ цыплят, выращиваемых на подстилке из стружек, контаминированных штаммами, вызывающими острое заболевание.

Таблица 16.2 Серотипы и патотипы герпесвирусов птиц

Серотип

Патотип

Штаммы представители

1

Mild (mMDV) Virulent (vMDV) Very virulent (vvMDV) Very irulent+(vv+MDV)

HPRS-B14,CU2,Conn-A HPRS-16,JM, JA; RB1B, ALA-8, Md5,Md11 610A, 648A

2

He онкогенный

SB-l, HPRS-24, 301B/1

3

He онкогенный

HVT-FC-126, HPRS-26

Этим, по существу, моделировано естественное двойное заражение в полевых условиях. В результате авторы установили интересный факт: птицы, зараженные одним штаммом (острым или слабым), были защищены от заражения другим шт. У отдельных цыплят виремия не была постоянной по титру, у некоторых птиц состояния виремии и невиремии чередовались. Различные типы цыплят реагировали на заражение по-разному (при одновременном заражении одной и той же окружающей среды); не ясно, являлось ли это результатом действия материнских AT и фактом наличия у цыплят ВГИ. Виремия, вызванная штаммом острой формы БМ (ID-1), наблюдалась у белых ледторнов уже на 1-й недели после заражения, а у птиц мясного типа — на 2-й неделе. Реакция птиц разных генетических линий при содержании их в одной и той же инфицированной среде оказалась различной.

Churchill и Biggs работали с двумя штаммами ВБМ (JM и JA), которые поддерживались на однодневных цыплятах. Последних заражали кровью с интервалом 4—6 недели. В результате авторы показали, что шт. JM вызывал высокую смертность цыплят с большими поражениями периферических нервов и половых желез, тогда как смертность цыплят от шт. JA была непостоянной, с более продолжительным латентным периодом. Присутствие шт. JA в организме зараженных цыплят характеризовалось следующими сроками: в почках вирус обнаруживали через 2 недели, в яичниках — к 7-й неделе, в печени и селезенке — к 8-й неделе и в головном мозге — к 4-й неделе после заражения. Шт. JA оказался более висцеротропным, так как при заражении им антигены выделялись на 9 дней раньше в печени и на 4 дня раньше в 12-перстной кишке и легких, чем при заражении шт. JM. Только при инфицировании шт. JA у птиц развивались опухоли в печени, сердце и селезенке, тогда как шт. JM был более нейро-тропным и обладал большим тропизмом для гонад, чем шт. JA, что подтверждалось более ранним выявлением вирусного АГ и более тяжелыми поражениями периферических нервов и гонад.

Sohet К. and Calnek В. описали новый изолят ВБМ: — вирус SB клон SB-1, который отличался от патогенных изолятов характеристиками роста in vitro, как описано для других апатогенных изолятов. Он не вызывал поражений, характерных для БМ, в течение 11-недельного экспериментального периода и оказался неонкогенным. Однако при определенных условиях он может являться причиной воспалительного типа инфекции. Поэтому для классификации этого и похожих изолятов был предложен термин «неонкогенный» и «апатогенный». Клон SB-1 защищал цыплят от вирулентного ВБМ и опухолевой трансплантации. Авторы при помощи гистологических исследований выявили различие между изолятами SB и HN-1, с одной стороны, и изолятом CU-2 с другой. Цыплята, зараженные CU-2, имели значительные поражения нервов, характеризующиеся обильной инфильтрацией большого количества лимфобластов, либо слабой лимфоцитарной инфильтрацией. В других органах, особенно в головном мозге и печени, наблюдались типичные для БМ поражения.

Purchase привел ряд биологических маркеров, которые можно использовать для распознавания различий между вирулентными и аттенуированными шт. ВБМ и ВГИ. Такими маркерами являются: патогенность; морфология бляшек и цикл репродукции; АГ различия; круг хозяев (спектр патогенности); патогенность для клеточных систем.

Онкогенные свойства. Проявляются не у всех штаммов ВБМ. По механизму онко-генного действия этот вирус значительно отличается от других онкогенных вирусов. Считают, что ВБМ трансформирует только Т-лимфоциты. В одной трансформированной клетке выявляют до 20 эквивалентов генома ВБМ. Онкогенные варианты вируса, по-видимому, кодируют характерные для них АГ детерминанты, отсутствующие у неонкогенных вариантов. Наиболее четкие различия наблюдаются в характеристике гликопротеида (gp5), позволяющие разграничить среди штаммов вируса варианты с высоко - и низкоонкогенными свойствами, а также отличить ВБМ от ВГИ. По этому критерию выделены два варианта ВГИ.

Все опухолевые клетки содержат от 3 до 12 геномов ВГМ на клетку, причем 90 % вирусного генома транскрибируется с кодирующей нити двухнитевой ДНК. Транскрибированная вирусспецифическая РНК В разных клетках кодируется одним и тем же фрагментом ДНК.

Локализация вируса, вирусоносительство И Вирусовыделение. У птицы с признаками болезни вирус обнаруживают в крови. По организму он разносится лейкоцитами крови и размножается в клетках лимфоидных органов (фабрициевой сумке, селезенке, тимусе, миндалинах, слепой кишке), лимфоидных очагов инфильтрации, эпителиальных клетках почечных канальцев и особенно перьевых фолликул, где найдены зрелые вирионы, покрытые оболочкой. Вирус также содержится в лимфоретикуляр-ных клетках гребня, сережек и голени. В первую неделю его обнаруживают в тимусе, селезенке и бурсе, в результате чего развивается персистирующая инфекция клеток белой крови. Выделить вирус в свободном состоянии не удается. В перьевых фолликулах вирус находится у инфицированных птиц всех возрастов независимо от метода заражения. Он содержится в слущивающихся клетках.

Патогенез и иммунитет при болезни Марека имеют исключительные особенности, накладывающие отпечаток на эпизоотологию и профилактику инфекции. Вирусоносительство, виремия и вирусовыделение после переболевания сохраняются практически всю жизнь, несмотря на устойчивость и присутствие ПА и ВНА. Даже вакцинация не предотвращает вирусоносительство и способность к контактному заражению. Более того, частота виремии на неблагополучных фермах выше у здоровых цыплят, чем у больных. Иными словами, переболевание или иммунизация практически не влияют на циркуляцию эпизоотического вируса. Высоковирулентные штаммы вызывают гибель однодневных цыплят. При заражении их слабо вирулентными штаммами они остаются носителями вируса в течение всей жизни, несмотря на устойчивость и присутствие ПА и ВНА.

Больная птица выделяет вирус через органы дыхания и пищеварения, а также с де-сквамированным эпителием кожно-перьевых фолликул, эпителий которых служит местом размножения вируса. Установлена прямая связь между созреванием вируса в клетках фолликул и контагиозностью болезни. Вирусоносительство отмечено у клинически здоровой птицы не только во время инкубационного периода, клинического проявления болезни, но в течение 16—24 месяцев после переболевания, практически пожизненно, при наличии у такой птицы специфических (РН, РДП) AT в 80—90 % случаев.

Из эпителиальных клеток перьевых фолликул удалось получить очищенный вирус. Высушенные эпителиальные клетки перьевых фолликул сохраняют инфекционность для цыплят при аэрогенном заражении. Присутствие клеточно-свободного ВБМ в перьевых фолликулах зараженных суточных цыплят впервые обнаружено в 1970 г. Вирус обнаруживался в фолликулах через 2 недели после заражения, концентрация его там нарастала с 3-й по 5-ю неделю и снижалась к 6 и 7-й неделе после заражения, 90—100 % цыплят, зараженных вирулентным вирусом БМ в возрасте 0—2 недель, спустя 2 недели имели генерализованную инфекцию в перьевых фолликулах, вирусный АГ персистирует в них несколько месяцев.

У экспериментально зараженных суточных цыплят появление ИФ АГ в коже отмечалось с 56-го дня. В этот срок в коже наблюдали специфическую ИФ в 50%, в очинах пера — в 90 % случаев, в то время, как преципитирующий АГ в этот срок и от тех же цыплят был установлен у 70,5 % зараженных цыплят. Выделение вируса из кожи и очин пера в культуре клеток удавалось в 87,5 % случаев. Клеточно-ассоциированный ВБМ выявляется в легких, лимфоидных органах через 1-4 дня после заражения, в лейкоцитах — позже. Затем он выявляется в нервах, головном мозге, печени, почках, гонадах. Титр вируса достигал пика в течение 2- недель после заражения. Далее инфекционность снижалась, но улавливалась еще 55 дней. Однако, в этих органах не происходило созревания полного инфекционного вируса.

Что касается клеточно-свободного ВБМ в организме зараженных цыплят, то помимо эпителия перьевых фолликулов он формируется в фабрициевой сумке в среднем в 52—55 % случаев. Выявить вирус в других органах (нервы, селезенка), а также в опухолях в этот период не удавалось. Это свидетельствует о том, что в других тканях и органах изменения являются вторичными и находятся под влиянием иммунологических процессов.

Аналогичные данные получил Purchase. Он отметил, что вирусный АГ может длительно выявляться в перьевых фолликулах (несколько месяцев), в то время как в висцеральных органах или невральных вирусиндуцированных опухолях он в поздние сроки либо отсутствовал вовсе, либо обнаруживался в небольшом количестве клеток. Не ясно, почему выделение вируса происходит лишь через перьевые фолликулы; между тем вирусный геном присутствует и в других клетках больных кур, поскольку заболевание может быть искусственно передано свободными от вируса интактными клетками. Пока неизвестно, что мешает полной экспрессии вируса в этих клетках.

АГ ВБМ содержатся у больной птицы в эпителии перьевых фолликул. По содержанию их у экспериментально зараженных цыплят установлены значительные различия между онкогенным и неонкогенным ВБМ. В перьевых фолликулах, соответствующих онкогенному вирусу, содержалось достаточно АГ, реагировавшего в РДП через 3—6 недель после заражения. Материал из фолликул, инокулированных неонкогенным вирусом в РДП, за редким исключением реагировал отрицательно. Таким образом, исследование экстракта из перьевых фолликул в РДП может служить простым тестом для обнаружения онкогенной инфекции цыплят, а обнаружение ИФ и преци-питирующих АГ в очинах перьев представляет собой надежный метод лабораторной диагностики.

У зараженной птицы образуются гуморальные AT, способные нейтрализовать вирус in vitro. Через 1—3 недели после заражения или вакцинации в крови цыплят обнаруживают ВНА и ПА. В 85 % случаев вирусный АГ выявляют в фолликулах кожи. У цыплят, зараженных вирулентным вирусом, AT чаще обнаруживают в тех случаях, когда птицы остаются здоровыми, и значительно реже у больных птиц или в случаях персистирующей инфекции. Инфицированные несушки передают потомству через яйцо ПА, которые обычно сохраняются до 3-недельного возраста и не защищают против экспериментального заражения воднодневных цыплят.

Экспериментальная инфекция. Ранее предпринималось много попыток экспериментальной передачи БМ. Однако впервые болезнь была успешно и неоднократно передана лишь в начале 60-х годов. Оказалось, что кровь или опухолевый материал, содержащий живые интактные клетки, могут передавать заболевание чувствительным однодневным цыплятам. Любые обработки инокулята, которые убивают клетки или разрушают их целостность, разрушают и инфекционность вируса.

Цыплят удавалось заражать внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, интрацеребрально, интранефрально. Чувствительность к экспериментальному заражению выше у цыплят суточного возраста, чем у 2—3 и 10 недельного. Суточные экспериментально зараженные цыплята после инокуляции вируса выделяют его со 2-й до 3-й недели. Микроскопические поражения развиваются уже на 2-й неделе, а макропоражения и симптомы болезни проявляются не раньше, чем на 4-й неделе или даже позднее. При заражении суточных цыплят в нос апатогенным шт. ML-6 вирусные внутриклеточные АГ были обнаружены на 3-й день в легких, на 5—14-й день — в лимфоидных органах и на 14—30-й день — в фолликулах перьев. Вирус изолирован из селезенки на 34—30-й день. После 10-го дня в сыворотке методом ИФ выявлялись AT

Смертность экспериментально зараженной птицы от 0,2 до 79,9 % При наблюдении в течение 65—210 дней. Все цыплята, зараженные в суточном возрасте, как правило, погибают, в то время как гибель 2-, 3- и 10-недельных цыплят составляет соответственно 60, 30 и 10 %. Возрастная устойчивость обусловлена различной способностью организма цыплят продуцировать специфические AT Наличие у цыплят материнских пассивных AT к ВБМ защищает их от заражения. Введение суточным цыплятам лимфоцитов от больных цыплят после предварительного их культивирования in vitro ведет к развитию болезни. Полагают, что возможна интеграция ВБМ с геном клеток кур (лимфоцитоз).

При остром течении экспериментальной инфекции клиническое проявление болезни отмечено через 20—85 дней, первоначальные патоморфологические признаки — через 21—60, гистологические изменения — через 12—21 день. Специфические AT в сыворотке крови и вирусспецифический АГ в эпителии перьевых фолликулов выявлены соответственно через 21—28 и 28—60 дней. При экспериментальном заражении вакцинированных 3-недельных цыплят вирусный АГ в перьевых фолликулах появляется через 1—5 недель и при смертельном исходе выявляется до момента гибели, а у выздоровевших птиц постепенно исчезает.

При экспериментальном заражении однодневных SPF-цыплят непатогенным вирусом ML-6 БМ серотипа 2 внутриклеточные вирусные АГ (VJAS) обнаруживали в селезенке и фабрициевой сумке через 5—14 дней, в легких — через 3 дня и в перьевых фолликулах — спустя 14—30 дней после заражения, но не обнаруживали в этих органах (кроме перьевых фолликулов) через 21 день после заражения. В период через 5—14 дней после инфицирования наиболее часто были инфицированы ВБМ делящиеся В-клетки фабрициевой сумки и селезенки. Таким образом, при инокуляции цыплятам вируса ML-6 его репликация происходила в лимфатических органах первоначально в Ь-клетках бурсы и селезенки.

Чувствительность к экспериментальному заражению у птиц разных пород и линий неодинакова; чаще болеют куры мясных пород и особенно белые плиму троки. В 1969 г. Сиккорди высказал мысль, что БМ — инфекция лимфоцитов, поэтому заразить птиц до начала функционирования у них лимфоцитов не удается. Инфекция лимфоидных клеток приводит к трансформации и образованию специфического опухолевого АГ, пролиферации и образованию опухолей. После инъекции небольшого количества неповрежденных опухолевых клеток ВБМ здоровым, но восприимчивым к заболеванию цыплятам не удается снова выделить из этих клеток вирус. И только в редких случаях удавалось получить вирусные частицы из опухолевых тканей зараженных птиц.

Экспериментальная инфекция суточных цыплят изучена при различных методах заражения: интраперитонеальном, интраназальном, внутриглазном, в переднюю камеру глаза. В качестве инокулята использована цельная кровь, суспензия клеток яичников, нервов и эпителия фолликулов. Авторы показали, что частота заболеваемости зависела от вида инокулята и метода заражения. Экспериментально вызванное заболевание было сходно с классической формой. Первое микроскопическое изменение — адвентициальная клеточная пролиферация головного мозга. Она наблюдалась во всех случаях с 1-й по 8-ю неделю после заражения. Следовательно, ткань головного мозга первой отвечает на заражение ВБМ. Вирус, введенный в глаз экспериментальным цыплятам, вызывал три формы БМ. Наблюдались изменения в глазу, конъюнктиве, хрусталике, целлюлярном теле и сетчатке, которые ранее не были описаны. Рецидивов иридоциклитов не отмечали. Выделенный вирус по его патогенным характеристикам относится к группе велогенных агентов.

Экспериментальная инфекция шт. HPRS-B14 характеризуется поражениями периферических нервов. У некоторых цыплят развивались лимфоидные опухоли, главным образом, в яичниках. Экспериментально вызванная БМ практически почти не отличается от естественной, разница лишь в длительности латентного периода. Куры оказались более чувствительными к шт. HPRS-B14, чем петухи.

Цыплята без материнских AT, зараженные экспериментально, гибли через 10—17 дней после периода депрессии и остановки роста. Вирус всегда присутствовал в крови цыплят с клиническими симптомами болезни. Титр вируса в крови составлял Ю-з, б_ 104,2 ИД so/мл- Плазма цитратной крови после центрифугирования ее при 2000 мин-1 была также инфекционна, но содержала меньше вируса, чем цельная кровь. Около 95 % инфекционности цельной крови связано с ее клеточной фракцией. Быстрое замораживание до -70 °С сильно снижало инфекционность опухолевой суспензии и цельной крови.

БМ была воспроизведена экспериментально на 10—11-дневных КЭ и 1—7-дневных цыплятах при инокуляции им крови и взвеси опухолевых клеток, смывов со скорлупы яйца и суспензии из перьевых фолликулов. Инфекционность суспензии из перьевых фолликулов была самой высокой и вызывала заболевание 52 % зараженных цыплят и 57,5 % КЭ. Патогенность изолятов ВБМ установлена для цыплят 1—7-дневного возраста и 10—И-дневных КЭ независимо от способа введения инокулята. Возбудитель, выделенный из крови, перьевых фолликулов от домашних кур и диких птиц, оказался идентичным.

При внутривенном заражении эмбрионов в 10- или 17-дневном возрасте цыплята вылуплялись нормально, но заболевали БМ после инкубационного периода такой же продолжительности, как цыплята, зараженные в однодневном возрасте. Заражение 10-дневных КЭ в аллантоисную полость вызывает БМ у вылупившихся цыплят. При заражении КЭ в желточный мешок вирусом, вызывающим классическую форму БМ, отмечали перикардиты, спленомегалию и наличие бляшек в селезенке.

У экспериментально зараженных цыплят первые клинические проявления болезни отмечались через 5 недель после заражения. Течение болезни имело три периода: с 5-й по 15-ю неделю отмечалась вялость, атаксия, потеря координации движения, диарея, бледность сережек и гребня, далее с 15-й по 30-ю неделю — постепенное ослабление нервных симптомов, исчезновение диареи, появление позы пингвина и, наконец, с 30-й по 56-ю неделю часть птиц находилась в позе пингвина. С 34-й недели клинические проявления болезни исчезали, но птица была очень ослаблена по сравнению с контрольной. Цыплята, выжившие после экспериментального заражения ВБМ в 2—3-недельном возрасте, являлись носителями вируса до 16-24-месячного возраста. Вирус у таких птиц содержался в крови до 24-месячного возраста.

Контактный способ заражения птицы в экспериментальных условиях оказался таким же эффективным, как и внутрибрюшинный — введение вируссодержащей крови больных птиц-доноров. Контактно зараженные ВБМ цыплята погибали от БМ через 4 месяца.

Изучали хронологически инфекцию ВБМ мозга при заражении 3-недельных цыплят двух генетических линий двумя штаммами серотипа 1. Они представляли собой два патотипа (v и vv+). Репликация вируса в мозге строго ассоциировалась с развитием поражений. В мозге зараженных цыплят выявлялись три антигена: рр38, gB и meq. Заметное различие между двумя патотипами выражалось в уровне репликации вируса, времени течения поражений мозга, в экспрессии антигена ГКГ. У мышей, зараженных w+, выявлялись воспалительные и пролиферативные изменения, при заражении v — только воспалительные поражения. Воспалительные поражения состояли преимущественно из макрофагов, Т-клеток CD4+ и CD8+, появлявшихся на 6—10 день после инокуляции. Они были преходящи. Пролиферативные изменения характеризовались тяжелыми инфильтратами Т-клеток CD4+CD8+ (бластами), начиная с 19—26-го дня после инокуляции, которые персистировали. Экспрессия антигенов МНС в эндотелиальных и инфильтрирующих клетках определялась в мозге инфекцией ВБМ. Во всех группах повышалась регуляция антигена ГКГ класса II, хотя была более тяжелой у инокулированных ¥+. Уменьшение регуляции антигена ГКГ класса I выявляли только при заражении ВБМ w+.

Индюки оказались менее чувствительны к культуральному ВГИ, чем куры, но более чувствительны к заражению лейкоцитарной кровью, содержащей ВГИ.

Вопрос о чувствительности индюшат к ВБМ имеет противоречивое толкование. По одним данным у 3 из 7 зараженных индюшат развились лимфоидные опухоли, причем 2 из них пали на 43-й и 50-й день после заражения. Ни один из зараженных индюшат не имел ПА и реизолировать от них ВБМ не удалось. В итоге сделали вывод о нечувствительности индюков к экспериментальной инфекции БМ.

Однако в 1977 г. показана высокая чувствительность индюшат к шт. Джорджия ВБМ. Заражали ВБМ суточных цыплят и индюшат путем введения инфекционной плазмы или гомогената опухоли и выращивали их в изоляции в течение 29 недель. Инокуляты оказались патогенными для цыплят и индюшат и вызывали высокую смертность (100 % у цыплят и 70 % у индюшат). Изменения наблюдали в печени, селезенке, легких и других висцеральных органах. Микроскопически пораженные ткани инфильтрированы плеоморфной популяцией неопластических лимфоцитов. Авторы не выявили изменений воспалительного характера. От экспериментально инфицированных цыплят и индюшат был реизолирован ВБМ и у этих птиц обнаружены ПА. Данная работа показала, что индюшата высоко чувствительны к экспериментальному заражению шт. ВМБ. Эти сведения были подтверждены.

В индюшиных стадах БМ не проблема. Возможное объяснение этого — присутствие у индеек ВГИ, который будучи АГ родственным ВБМ защищает индюшат от болезни.

Культивирование. ВБМ удается культивировать в организме однодневных цыплят и в КЭ 10—12- и 4-дневного возраста при заражении на ХАО и в желточный мешок, соответственно в культуре фибробластов и почечных клеток куриных и утиных эмбрионов, в культуре клеток почки 2—8-недельных цыплят малочувствительной к БМ линии. Заражение КЭ в желточный мешок ведет к образованию характерных бляшек на ХАО, поэтому некоторые исследователи считают использование эмбрионов эффективным методом выделения БМ.

Шт. В-14 ВБМ поддерживали внутрибрюшинной инокуляцией 1—2-дневных цыплят разных линий с интервалом 3—10 недель кровью, взятой от птиц с клиническими симптомами БМ. В течение 70—100 дней наблюдения за цыплятами на протяжении 40 последовательных пассажей заболевание у них колебалось в пределах 29—87 % у RIR, 12-40 у EBrL и 27-58 % у HPRS-BrL

В культуре клеток почек цыплят и фибробластов утиных эмбрионов ВБМ образует характерные бляшки. Хотя в первых пассажах этот вирус не вызывает образования бляшек в культуре клеток куриных фибробластов, но при дальнейшем пассировании в чувствительных культурах он приобретал эту способность, которая возрастала с увеличением количества пассажей. 1ДПЭ характеризовался образованием округлых ре-фрактильных клеток и поликариоцитов. Размер и число последних варьировалось в зависимости от типа культуры клеток и пассажа вируса. Зараженные клетки погибали, продуцируя большое количество вирусного АГ и голых вариантов, которые можно наблюдать в тельцах-включениях и ядрах большинства зараженных клеток.

Штаммы различаются по активности репродукции в культуре клеток, характеру ЦПД, морфологии бляшек и количеству клеточно-свободного инфекционного вируса. По морфологии бляшек можно дифференцировать вирулентные штаммы от слабо вирулентных. Так, шт. CPRL-11 ВБМ утрачивал патогенность (онкогенность) для цыплят после его серийного пассирования in vitro в клетках куриных эмбрионов. При длительных пассажах вируса в культуре клеток А-АГ исчезал, поэтому при изучении АГ структуры вируса он не должен пассироваться более 10 раз. По бляшкообра-зованию в культуре клеток штаммы ВБМ делят на три группы : высокоонкогенные, вызывающие в клеточных культурах образование бляшек средних размеров, и неон-когенные изоляты, вызывающие образование мелких бляшек; ВГИ и аттенуирован-ный ВБМ, вызывающий образование крупных бляшек. Высказана мысль о возможной связи между бляшкообразованием и патогенностью полевых штаммов ВБМ. ВБМ удавалось размножать в органных культурах почек, селезенки, гонад и легких цыплят 3—4-недельного возраста. Вирус не репродуцировался в культуре клеток млекопитающих, и все попытки в этом отношении оказались безуспешными.

Титрование ВБМ в культуре клеток основано на его свойстве образовывать бляшки без агарового покрытия, так как возбудитель является клеточносвязанным. Его также удавалось серийно пассировать и на суточных цыплятах, свободных от материнских AT, заражая их интраперитонеально в дозе по 500 БОЕ на цыпленка. С увеличением числа пассажей вирулентность вируса снижалась. Неспособность ВБМ в клеточной культуре выделяться во внеклеточную среду связана с его внутрицито-плазматической деструкцией. Данный вирус может быть в двух формах: тесно вязанным с клеткой и свободным от интеграции с какими-то клеточными структурами.

В организме инфицированной птицы вирус размножается и созревает только в эпителиальных клетках перьевых фолликул, где инфекционные вирионы связаны с большим количеством цитоплазменных клеточных включений. Эти включения, вероятно, связаны с синтезом бесклеточного инфекционного вируса. В тоже время было замечено, что вирус можно выделять из зараженных культур клеток, используя специальные методики их обработки (ультразвук, хелаты, бикарбонат-диамин — тетрааце-тат).

Аттенуированные штаммы ВБМ, а также природноослабленные вакцинные штаммы ВГИ не созревают в эпителии перьевых фоликулов цыплят, и поэтому вакцинированная вирусом этих штаммов птица не передает возбудителя посредством контакта.

Предложен простой способ дифференцирования in vitro ГВИ и ВБМ с использованием клеток линии Т35 (из опухоли японской перепелки). ГВИ образует в этой культуре мелкие бляшки, отсутствующие при заражении ВБМ. В настоящее время клетки Т35 успешно применяют для избирательного выделения и накопления ГВИ. Установлено, что гены USI, US10 (US2) не нужны для роста ВБМ в ФЭК. Делетиро-ванные гены не нужны для заражения цыплят. Проведен анализ распределения позитивных по АГ 1а - дентритных клеток, В-клеток и позитивных по ВБМ АГ клеток в лимфоидных органах и ХАО 13-дневных КЭ, инфицированных ВБМ серотипа 1, ВБМ изолята В и тремя вакцинными штаммами (CVI 988, SB1, HVT — 1 — 2 и 3-го серотипов соответственно). Ранее из опухолей, индуцированных мутантным вирусом болезни Марека (ВБМ), имеющим делецию в области US и содержащим маркерный ген lacZ, были получены перевиваемые линии лимфобластоидных клеток (ЛЛБК). Изучение этих ЛЛБК показало, что ЛЛБК не содержат родительского вируса и относятся к типу CD4+CD8+; доля экспрессирующих 3-галактозидазу клеток мала (1—3 %), но значительно увеличивается при обработке 5-иоддезоксиуридином; экспрессия lacZ индуцируется с такой же кинетикой, как и для генов литич. фазы ВБМ (рр38, USI, gB, gl и US 10; 4) в регуляции экспрессии lacZ не участвует метилирование. В клетках, экспрессирующих 3-галактозидазу и литич. антигены, экспрессируется и онкопротеин Meq ВБМ, но он не индуцируется при обработке 5-иоддезоксиуридином.

Эти данные показали, что регуляцию маркерного гена lacZ можно использовать для изучения литической фазы ВБМ и реактивации ВБМ из латентности. Репликация ВБМ и ВГИ в культурах фибробластов эмбриона цыпленка дозозависимо ингибиру-ется добавлением 5-нитрозо-1Ч-ацетилпеницилламина, порождающего N0. Обработка культур рекомбинантным гамма-интерфероном цыпленка и липополисахари-дом вызывает продукцию N0, которая подавляется Мс-монометиларгинином — ингибитором индуцибельной NO-синтетазы. ФЭК из устойчивых к ВБМ цыплят N2A (ГКГ В21В21) продуцируют 5-нитрозо-]Ч-ацетилпеницилламин раньше и в большем количестве, чем ФЭК из цыплят, чувствительных к ВБМ S13 (ГКГ В|3В13) и Р2а (ГКГ В19В19). Репликация ВБМ и ВГИ значительно подавляется в культурах, обработанных смесью гамма-интерфероном и липополисахарида, и продуцирующих NO. Этот эффект уменьшается при добавлении №-монометил-Ь-аргинина.

Заражение ВБМ цыплят, обработанных 5-нитрозогацетилпеницилламином, приводит к понижению вирусной нагрузки по сравнению с необработанными цыплятами. Эти данные позволяют предположить, что NO играет важную роль в репликации ВБМ in vivo. Гликопротеины gH и gL ВБМ экспрессировали в культуре клеток. Методом иммунофлуоресценции показано, что их экспрессия в одной и той же клетке необходима и достаточна для субклеточной транслокации и экспрессии на поверхности клетки. gL, экспрессированный в фибробластах эмбриона цыпленка рекомбинантным вирусом оспы птиц, секрутируется в культуральную среду. Связывание первичных пептидов обоих гликопротеидов происходит в цитозоле и в просвете эндо-плазматического ретикулума. Связывание gL с gL обеспечивает прикрепление к поверхности клеток и важно для распределения вируса в незараженные клетки. Домен связывания gH, важный для образования комплекса с gL состоит из остатков 451 -659 и кодируется фрагментом ДНК Sacl-Hindlll. Изучено in vitro формирование глико-протеинами Н и Z вируса болезни Марека гетеро-олигомерных комплексов необходимых для проникновения вируса в клетку.

Источники и пути передачи инфекции. Главный источник болезни — больная птица. Входные ворота — респираторные пути. Больная птица выделяет вирус через дыхательный и пищеварительный тракты, с шелушащимся эпителием перьевых фолликулов и перхотью (клеточно-свободный вирус). При остром течении болезни процент гибели птицы варьирует в широких пределах и иногда превышает 10—15 %. При классическом заболевании поражается обычно 10—30 % поголовья, а смертность, как правило, ниже. Вирус БМ среди цыплят распространяется путем прямого и косвенного контакта, а также по воздуху. Заражение происходит путем вдыхания инфекционного материала (перья, перхоть и пыль помещения). Пыль и перо длительное время остаются инфицированными. При температуре 17, 22 и 4 °С инфекционность вируса сохраняется по меньшей мере 10 месяцев (срок наблюдения). В условиях термостата (37 °С) он выживает 5 месяцев. Кожные чешуйки и сухие перья сохраняют инфекционность 55 дней. В пыли птицеводческих помещений вирус в высушенном состоянии сохраняется до 1,5 лет. Инфекционны также подстилка и помет инфицированных цыплят. Обратная связь между содержанием влаги и инфекционностью подстилки может указывать на то, что инфекционный материал переходит в аэрозоль и вызывает инфекцию, либо на большую устойчивость вируса в сухом состоянии. Обе гипотезы приемлемы, поскольку пыль птичников, которая содержит легко аэрозолирующие частицы и очень мало влаги, также является источником инфекции.

Экспериментальное применение выпадающих при линьке перьев или пыли путем ингаляции и трахеального введения вызывало заболевание птиц. Помимо подстилки и помета инфекционной оказалась пыль, собранная с вентиляционной системы, поверхности электрооборудования и подоконников. Начиная со 2 или 3-й недели после заражения, цыплята выделяют вирус во внешнюю среду. Десквамированные клетки кожи и перхоть птичников оболочек пера, являясь основными компонентами пыли, служат основным средством передачи вируса.

Сохранение вируса в окружающей среде и его передача аэрогенным путем — причина высокой контагиозности заболевания. Цыплята в основном заражаются через респираторный путь. Описана овариальная передача, но есть сведения, отрицающие это. Наблюдалось, что большие группы коммерческих цыплят, выращенных в изоляторе, не заражаются. Это указывает, очевидно, на то, что передача через яйцо — редкий феномен. Таким образом, эпителий респираторного тракта — ворота для проникновения вируса. Наличие вирусспецифического ИФ АГ в эпителии легких подтверждает эту возможность. Передача инфекционного вируса по воздуху вызвана с 1 - й недели жизни цыпленка-донора и продолжается в течение 3 недель пребывания в контакте со здоровой птицей. Наибольшее число случаев респираторного заражения отмечено на 2—3-й неделе жизни цыплят-доноров.

Птицы, выращенные в новых помещениях, часто тяжело заболевали. Это явление известно как синдром нового помещения. Иногда результаты выращивания птиц были лучше при весьма негигиенических условиях: на старом помете или небольших количествах его. Это называлось «контролируемым воздействием». Обычно отход среди кур-несушек в период роста составлял 10-15 %, иногда до 50 %. Среди молодок, начинающих нестись, отход был небольшой, около 1 % в месяц, но к концу 18-го месяца, только половина птиц несла яйца.

Птицы-носители непатогенного (природноослабленного) ВБМ пожизненно остаются источником инфекции. Интересно, что наличие патогенных штаммов ВБМ возрастает с увеличением возраста популяции птиц. Исход БМ зависит от вирулентности эпизоотического штамма, возраста зараженной птицы и ее генетически обусловленной резистентности.

В последние годы было обнаружено изменение в распространении БМ. Происходит определенная эволюция этой болезни: с 1968 г. процент стад с зарегистрированным заболеванием был стабильным — от 5,8 до 8,0 % в разные годы. Хотя заболевание распространено и в некоторых хозяйствах носило эндемический характер, наблюдается заметное снижение летальности и потерь. У бройлеров БМ диагностируется редко. У ремонтного поголовья средний процент летальности от этой болезни в инфицированных стадах достигает 3—6 и только в некоторых случаях наблюдались потери до 20—25 %.

Поскольку вирус содержится в пыли помещений, где содержится больная птица, этот материал долго остается инфекционным: перхоть — 4 недели, пыль — 6 недель и подстилка — до 16 недель. Вирус также может передаваться жуком-чернотелкой Alphiobrus diaperinus, имаго и личинки которого обнаружены не только в соломенной подстилке помещений бройлеров, но и в подкожной клетчатке больной птицц. Свободно летающие дикие птицы — возможные переносчики вируса. Из суспензии органов (печень, почки, селезенка) 164 исследованных птиц, относящихся к 12 видам, вирус выделен у четырех: от трех ворон обыкновенных и одного скворца рода майна. При внутрибрюшинной инокуляции суточным цыплятам суспензии из напившихся кровью комаров через 4 недели обнаружили БМ у 9 из 14 и у одного из 16.

Что касается вертикальной передачи БМ, то есть сведения, что цыплята, полученные из яиц неблагополучных хозяйств и выращенные в изоляции, не заболевали. При заражении у них появились антитела и многие цыплята погибали. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии передачи с яйцом от матери потомству.

В естественных условиях БМ диагностирована у кур, индеек, перепелов, фазанов, уток, лебедей и куропаток. Вирус изолирован от птиц 10 видов, относящихся к роду Gallus. Установлена также и чувствительность японских перепелов. Однако данных о распространении инфекции у этого вида и о том, каково эпизоотологическое значение этого естественного резервуара вируса нет. Вылупившиеся японские перепела (Coturnix coturnix Japonica) устойчивы к вирулентному ВБМ. Изменения, сходные с поражениями при БМ, отмечены у фазанов, уток, сов, перепелов, лебедей, куропаток, но этиологическая специфичность этих изменений осталась не установленной. Вирус выявлен в тканевых гемогенатах от три ворон и одного скворца. К видам, устойчивым к лабораторному заражению ВБМ, относятся воробьи, голуби и различные млекопитающие, однако у уток имеются AT к вирусу. Не выявлены ПА к ВБМ у цесарок, уток и городских голубей. Только куры являются основным, хотя и не единственным, резервуаром инфекции.

Опубликованы интересные экспериментальные данные о проявлении феномена клеточной связанности степени патогенности штамма ВБМ, вида ткани в зависимости от метода заражения и сроков исследования птицы после ее инфицирования. Изучали сравнительный патогенез БМ у цыплят, экспериментально зараженных высокопатогенным шт. HPRS-16, аттенуированным YHRS-16 и природноослабленным (апатогенным) HPRS-26. Было установлено в мозге, нервных сплетениях, легких, печени, почках, гонадах, тимусе, селезенке, бурсе, коже эпителии перьевых фолликулов, что пик накопления клеточно-ассоциированного вируса приходился на первые 2 недели после заражения. Наибольшая концентрация всех трех штаммов ВБМ обнаружена в легких, селезенке, печени. Первоначально клеточно-ассоциированный вирус выделяли через 1 день после заражения в селезенке (патогенный шт. НРР-16), через 4 дня — в легких, тимусе, селезенке, печени (аттенуированный шт. НРР-16). В наиболее высокой концентрации обнаруживался патогенный шт. НРР-16, тогда как для аналогичного аттенуированного она была самой низкой. Интересно, что перьевые фолликулы и бурса становились позитивными в отношении ВБМ только после того, как последний был выявлен в легких, селезенке и тимусе. В отличие от этих результатов выявлена наибольшая концентрация клеточно-связанного вируса в эпителии перьевых фолликулов у птиц, инфицированных контактно или внутрибрюшинно.

Изучены сроки созревания в перьевых фолликулах патогенного (Jd-1) и апатоген-ного (HN) штаммов ВБМ при двойной инфекции цыплят. Оба штамма одновременно вводили 2-недельным цыплятам (породы белый леггорн C-WH и высокочувствительной к данному вирусу линии WSU-VS) подкожно и путем контакта. В результате подкожного заражения оба штамма были обнаружены через 2, 4, 6 недели в крови всех кур линии WSU-VS и 50 % кур линии C-WH. Через 2 недели после заражения оба вируса были обнаружены в перьевых фолликулах птиц обеих линий. Куры могут не только одновременно инфицироваться двумя вирусами различной степени патоген-ности, но иметь виремию в сроки, зависящие от генетической чувствительности их к ВБМ.

Факторы резистентности птицы. Возраст птицы — важный фактор природной резистентности. Несмотря на то, что опухоли у кур возникают незадолго до зрелого возраста, наиболее чувствительными птицы не в этот период. Только что вылупившиеся из яйца цыплята более чувствительны к экспериментальному заражению, чем цыплята 4 или 12 недель. При изучении распространения БМ в Индии показали, что наибольшая заболеваемость наблюдалась в группе кур 26-недельного возраста (80,08 %), к 71-й неделе заболеваемость составляла 11,7 %. Не у всех пород кур чувствительность к ВБМ снижается с возрастом одинаково; у некоторых она сохраняется в течение 8 недель, а затем резко падает. Возрастная резистентность не зависит от бурсоэкто-мии, не исчезает она и при тимэктомии. Это подтверждает, что возрастная резистентность не обусловлена Т-клетками.

Условия, в которых выращиваются птицы, могут играть определенную роль в уровне природной резистентности: любые случаи стресса могут считаться причиной эпизоотических форм опухоли. Переезды на дальние расстояния, изменения режима питания, принудительное воздействие искусственным светом, подрезка клюва с целью избежания несчастных случаев и даже перемещения в другие клетки относятся к факторам, снижающим резистентность птицы к ВБМ.

Наряду со «спонтанным» иммунитетом, который может передаваться птицам по родительской линии, существует и природноприобретенный иммунитет. В некоторых стадах, где процент смертности от БМ низок, можно выделить вирус герпеса более низкой патогенности по сравнению с родоначальным вирусом, вызывающим 100 %-ную смертность. Куры из подобных стад благодаря их естественному заражению природ-ноослабленным эпизоотическим вирусом приобретают резистентность к повторному заражению патогенным вирусом. Некоторые больные птицы, зараженные вирусом со средней патогенной способностью (30—60 % смертности), могут выздороветь клинически. Такая возможность редка и обычно птицы, пораженные клиническими формами болезни, погибают. Но среди птиц со слабыми гистологическими изменениями определенное число выздоравливает полностью, без дальнейшего проявления клинических признаков. Это утверждение основывается на высокой частоте выявления гистологических изменений во время убоя партий зараженной птицы, взятых наугад. Частота таких изменений с возрастом уменьшается. Таким образом, купирование гистологических изменений является возможно после заражения слабопатогенным вирусом, что позволяет предполагать наличие постинфекционного иммунитета кБМ.

Изучение генетически обусловленной устойчивости начали с аутобредных стад цыплят промежуточной чувствительности. Удалось в двух генерациях путем селекции чувствительных и устойчивых пород получить стада птиц, различающихся по чувствительности к БМ. Средний падеж от БМ у генетически устойчивых, или N-линии, составлял 6 %, а у генетически чувствительной, или Р-линии, — 94 %. Этот метод селекции был быстро заимствован птицеводческой промышленностью.

Изучали сравнительную чувствительность некоторых инбредных кур (CW, CXW, F1) в ВБМ. В итоге установлено различие в чувствительности к БМ и в способности продуцирования специфических антител. Среди птиц линии Ц наблюдалась наибольшая выживаемость после заражения. Леггорны, по-видимому, более устойчивы (летальность 6,1 %), тогда как у помесей леггорн и родайленд более высокий процент (12) летальных исходов.

Интересные результаты были получены при изучении влияния различных доз ВБМ на развитие виремии, время выживания и смертность у цыплят двух линий: высокочувствительной (красный родайленд) и умеренно-резистентной (светлый Суссекс). У цыплят чувствительной линии доза вируса не влияла на частоту заболевания, но падеж быстрее наступал у птиц, которые получили более высокую дозу вируса. При изучении механизма генетической резистентности выяснилось, что у резистентных птиц ниже уровень виремии, и больше уровень ВНА, чем у чувствительных. Однако AT, очевидно, не ответственны за резистентность, поскольку бурсэктомия не влияла на развитие резистентности. ВБМ может вызывать прогрессирующие опухоли на месте введения. Рост или регрессия трансплантируемых опухолей не зависит от генетической чувствительности птиц к БМ. Частота возникновения опухолей у хозяина зависит от генетической чувствительности его к БМ.

Повышение генетической устойчивости к БМ представляет большой интерес для науки и практики. Ген SORF-2, кодирующий белок из 179 аминокислот, найден только в вирулентных штаммах MDV (серотип 1). SORF-2 гомологичен ORF4 НБ и птичьего аденовируса, а также человеческого цитомегаловируса и герпесвируса 6, белкам с трансактивирующей способностью. Установлена коэк-спрессия GH (гормон роста) и SORF-2 в MDV-инфицированных клетках как in vitro так и in vivo. Полиморфизм в GH-гене связан с большим количеством тканей с опухолями в коммерческих цыплятах породы белый леггорн с генотипом ГКГ В 2/В 15. Возможно, что GH-ген может быть геном устойчивости к БМ.

Иммунитет и специфическая профилактика. БМ — единственная поддающаяся вакцинопрофилактике опухолевая болезнь. Предложена гипотеза о двух стадийной им-мунологически индуцированной резистентности при БМ. На первой стадии решающая роль отводится противовирусному иммунитету. Эта стадия характеризуется продукцией ВНА, снижением виремии и ингибициеи репликации вируса. Тем самым предотвращается деструкция лимфоидной ткани. Kato и Hirai предположили наличие трех основных объектов-мишеней, против которых направлены противовирусные и противоопухолевые иммунологические реакции: вирион ВБМ, инфицированная клетка и клетка лимфомы БМ. Против первой мишени направлены ВНА; они подавляют его репликацию и снижают уровень виремии. Вторая мишень представлена клетками, инфицированными ВБМ, на которых образуются поверхностные АГ, реагирующие с АГ, локализованными на поверхности клеток, инфицированных вакцинными штаммами. Предполагают, что индуцированные вакцинным вирусом иммунные реакции направлены против антигенов-мишеней, образующихся на клетках, инфицированных онкогенньш ВБМ. Антителозависимый лизис клеток-мишеней осуществляют лимфоциты-киллеры (К-клетки). Наличие AT даже в небольших количествах обеспечивает условия для цитотоксического действия К - клеток.

Независимый от AT и комплемента лизис клеток-мишеней осуществляют непосредственным контактом натуральные киллеры (НК-клетки). Определенную роль в иммунитете на его ранней стадии играют макрофаги. В кооперации с В-клетками иммунизированных цыплят они могут инактивировать свободный ВБМ. Факторы клеточного иммунитета (лимфокины), выделяемые иммунными Т-лимфоцитами, активируют макрофаги. Третья мишень вакцинального иммунитета — клетки лимфомы Марека, которые содержат опухолеспецифический поверхностный АГ MATSA. Против этой мишени проявляют прямую цитотоксичность клетки-киллеры и макрофаги от цыплят вакцинированных ВБМ или ВГИ (мишень лимфобластоидные клетки MSB-1). Иммунитет при БМ заключается в противоопухолевой защите с помощью клеточных факторов, длительно сохраняющих свою активность за счет постоянного стимулирования персистирующим вирусом и уничтожения пораженных клеток. Это подтверждается иммуногенностью препаратов плазматических мембран клеток, зараженных in vitro вирусом БМ.

Иммунную систему птицы можно разделить на бурса - (В-клетки) и тимус зависимые (Т-клетки) систему. Клеточный иммунитет включает также АГ неспецифическую активацию различных клеточных популяций и, в частности, естественных киллеров. Иммунитет против БМ является тимус-зависимым процессом, поскольку вакцинация ВГИ не защищала бестимусных цыплят от БМ. Иммунизация цыплят авиру-лентными штаммами ВБМ или природными штаммами ГВИ надежно (в 90 % Случаев) защищает их от последующей спонтанной инфекции вирулентным штаммом ВБМ, клиническое проявление болезни отсутствует, хотя виремия имеет место. Механизм такого защитного действия неизвестен. Возможно, что в основе эффективности применения гетерологичной вакцины из ГВИ при БМ лежит не только АГ общность этих вирусов, а также и интерференция между ними. У цыплят, привитых ГВИ, иммунитет был более выражен при контактном, чем при подкожном заражении ВБМ.

Изучали влияние выделенного в Австралии патогенного штамма вируса болезни Марека (ВБМ, штамм MPF 57) и апатогенного вакцинного штамма ВГИ (штамм FC 126) на иммунную систему коммерческих бройлерных цыплят в течение 35 дней после заражения в возрасте 0 и 3 дней. Изучали также защитное действие вакцины из ВГИ на вызванную ВБМ иммунодепрессию. Определяли вариабельность иммунной системы, включая относительный вес лимфидных органов, фенотип лимфоцитов крови (CD45+/CD3+, предположительно Т, и CD45+/LC+, предположительно В), а также продукцию антител после вакцинации против инфекционного бронхита (ИБ) при высиживании, чтобы определить иммунный статус цыплят. Определяли также иммунодепрессию по чувствительности к вторичному заражению Е. coli на 29-й день после заражения ВБМ. Инфекция ВБМ уменьшала вес тимуса и фабрициевой сумки, количество циркулирующихТ - и В-лимфоцитов, титр антител против ИБ. Заражение ВБМ сильно повышало восприимчивость к заражению Е. coli. ВГИ вызывал сам по себе слабое уменьшение Т-и В-лимфоцитов, но не влиял на вес иммунных органов или титр антител против ИБ. Вакцинация ВГИ оказывала хорошее защитное действие против основных иммунодепрессивных влияний ВБМ, но не против вызванного ВБМ угнетения роста и слабого иммунного ответа на ИБ.

С помощью монАТ установлено, что гетероиммунитет обусловлен общими антигенными детерминантами трех гликопротеинов ВБМ (gp 115- 100, 63 и 50 кД) и ГВИ (gp 150—62 и 52 кД). Иммунизация кур и кроликов этими гликопротеинами индуцировала выработку AT, подавляющих репродукцию обоих вирусов.

В настоящее время имеется пять вакцин против БМ, в том числе три живых, изготавливаемых из онкогенных штаммов ВБМ серотипа Цаттенуированные шт. HRS-В16, Md-5), из естественно ослабленных неонкогенных штаммов серотипа 2 (CVI988, SB-1, С-80) и гетерологичных ВГИ серотипа 3 (FC-126 HVT), а также две инактиви-рованные вакцины из клеток или клеточных мембран культур клеток, зараженных вирусом.

Вакцины из природноослабленного (полевого) вируса. Протективная способность ВБМ серотипа 2 впервые установлена в 1972 г. Shat, Calnek сообщили в 1978 г. о выделении от клинически здоровых кур штамма SB-I. К ним относятся также шт. CV1 988, С-80. Вакцинный вирус, распространяется горизонтально. Rispens и др. впервые выделили природноослабленный ВБМ (CV1988) птицы от внешне здорового стада. После 20 пассажей в культуре клеток, этот вирус не вызывал даже незначительных поражений. Он сохранил А АГ. Вакцина «Риспенс» из шт. CVI988 (Голландия) пассируется на цыплятах. У вакцинированных цыплят виремия сохраняется более 2 лет (по тесту выделения вируса из перьевых фолликулов). AT у вакцинированной птицы вырабатывались в такой же степени, как у естественно переболевшей. Вакцинный вирус CV1988 от вакцинированных птиц не передается вертикально через яйцо. Вакцина клеточно-связанная и хранится в жидком азоте. По данным изготовителей, степень защиты привитых цыплят от вакцины CVI988 100 %, от вакцины из ВГИ 88,6 %. Аналогичные вирусы выделили Zaunder и др.(штамм ХН), Biggs и др.; в Китае выделен природно апатогенный шт. 4z, который рассматривается в качестве кандидата в вакцинные штаммы.

Вакцинные шт. CVI988 (серотип 1) и SB-1 (серотип 2) хорошо размножаются в организме привитой птицы и в культуре клеток и легко передаются горизонтально. Установлена корреляция между способностью аттенуированных шт. ВБМ передаваться горизонтально и их иммуногенностью. Способность к такой передаче вероятно связана с выраженной репродукцией вакцинного штамма в эпителии фолликулов.

Поствакцинальная виремия, особенно уровень размножения вируса в эпителиальных клетках перьевых фолликул привитых цыплят, является хорошим тестом им-муногенности вакцин. Штаммы длительно пассированные в культуре клеток, снижают способность к приживлению в организме привитых цыплят, а вместе с ней и им-муногенность.

Как уже указывалось, материнские антитела передаются потомству через желток, обеспечивая снижение заболеваемости и смертности, но не абсолютную защиту от ВБМ. Эти антитела обнаруживают у цыплят в течение 2—3 недель жизни. Если цыплята еще в период эмбрионального развития были инфицированы авирулентным штаммом БМ или ВГИ, то приобретают выраженную защиту от БМ при последующем инфицировании патогенным штаммом. Защитное действие проявляется примерно в 90 % случаев, клиническая картина БМ отсутствует, хотя виремия имеет место, а в крови вылупившихся цыплят содержатся антитела. Механизм этого явления не установлен. Материнские антитела не влияют на вакцинальный процесс, если в инокулируе-мом препарате превалируют зрелые формы вирионов мелкофокусного ВГИ и отсутствует или находится в незначительном количестве гликопротеидный антиген А. БМ у цыплят с материнскими антителами к ВБМ характеризуется однофазным течением. Первые изменения у таких цыплят появлялись через 14 дней после заражения в печени, почках, сердце и седалищном нервном сплетении. Наиболее ярко они были выражены с 56-го по 70-й день после заражения. Пассивно приобретенные (материнские) антитела сообщают некоторую защиту цыплятам от патогенного ВБМ, уменьшают уровень вируса у зараженных цыплят и задерживают развитие поражений. Видимо, можно допустить нейтрализующую активность циркулирующих пассивно приобретенных антител, in vivo воздействующих как на вирусные частицы, так и ци-толитически на зараженные клетки. Эта мысль подтверждена наблюдениями Calnek, показавшего в 1972 г. более тесную связь резистентности вакцинированных цыплят с присутствием ВНА, чем ПА. Не исключено, что быстро наступающая поствакцинальная защита цыплят обусловлена интерфероном.

Однако в 1974 г. Else не выявил связи между защитой привитых цыплят и присутствием у них ПА или ВНА. Автор полагает, что клеточно-опосредованный иммунитет является главным механизмом защиты, создаваемой вакцинацией, не отрицая при этом роли циркулирующих гуморальных антител. Вероятно правильной будет точка зрения, высказанная П. Пауэл и др., что при иммунизации против БМ и клеточно-опосредованный иммунитет и гуморальный ответ могут быть адекватными и в отдельности они не могут обеспечить защиту. Вакцинация предохраняет от развития лимфом путем уменьшения числа клеток. В настоящее время накопилось много данных, свидетельствующих в пользу гипотезы двухступенчатого вакцинального иммунитета при БМ. На первой ступени он направлен против вирусных антигенов, на второй — против опухолевых клеток-носителей поверхностного опухолеассоции-рованного АГ

Вакцины из модифицированных (аттенуированных) штаммов. Большинство измененных (аттенуированных) штаммов, за исключением выделенного Churchill и др., не распространяется горизонтально. В 1969 г. показано, что при пассировании ВБМ (штамма HPRS-B16) в культуре ФЭК свойства вируса менялись: он быстрее репродуцировался, образовывал макробляшки, утрачивал способность образовывать А АГ и аттенуировался. Опасности реверсии у экспериментально аттенуированных штаммов нет, поскольку вакцинный вирус в фолликулах привитой птицы не проходит полного цикла созревания. Аттенуированные вакцины куриного происхождения не инфицируют окружающую среду, и нет опасности их реверсии в патогенные. Коммерческую живую вакцину на основе шт. HPRS-16 ВБМ широко использовали в Европе, но впоследствии она была вытеснена другими вакцинами. Аттенуировали также другие штаммы (JM и JA), но применение их было ограничено. Получены также вакцины на основе аттенуированных умеренно вирулентных шт. ВБМ. Так, в 1971 г. разработана вакцина на основе штамма CVI988 (классический штамм). Вирус пассировали на культуре клеток утиных эмбрионов (20 и 35 пассажей). Он легко передается контактным путем, обсеменяя окружающую среду с 10-го дня после вакцинации. Недостаток вакцины — ее умеренная вирулентность для высокочувствительных линий цыплят. Вакцина из аттенуированного высоко вирулентного шт. Md 11/75C ВБМ длительное время проходит испытания.

В отношении иммунной активности вакцины обоих типов оцениваются положительно, но аттенуированные штаммы могут утратить иммуногенность в случаях продолжительного пассирования их в культуре клеток. Помимо указанного штамма, для аттенуации использовали и полевой изолят вируса болезни Марека, вызывающий классическую форму БМ; этот штамм аттенуировался методом серийных пассажей в КЭ. Наиболее известными аттенуированными вакцинными штаммами являются HPRS-B16, JM, GA, BK, Md-5, Кекава-55. Кроме того, известны шт. Md 11/75C/R2 и CV 1988/С (серотип 1), 301В/1, SB-1 (серотип II).

В программе борьбы с БМ в США официально используют три типа вакцин: HVT, SB-I и CVI986/C. Новый серотип ВБМ 301В/1 непатогенен, но более эффективен, чем SB-1. Разработан новый аттенуированный серотип ВБМ — MdII/75C/R2, который более эффективен, чем каждый из трех указанных в отдельности. Вакцины из этих штаммов клеточно-связаны и также хранятся в жидком азоте. У цыплят, привитых вакциной из этих штаммов, быстро развивается виремия и через 1—2 недели создается иммунитет. Вакцинный вирус не созревает до инфекционной формы, поэтому не передается горизонтально.

Н. П. Мазуренко и др. провели сравнительное изучение репродукции патогенного штамма ВБМ у цыплят, вакцинированных аттенуированным ВБМ (шт. Кекава-55) и ВГИ. Они показали, что аттенуированный штамм, в отличие от ВГИ, значительно подавляет репродукцию патогенного вируса в перьевых фолликулах цыплят.

Гетерологичные вакцины из ГВИ. Наиболее широкое распространение во всем мире получила вакцина на основе ГВИ (шт. FC-126), поскольку вирус не требовал аттенуации, не опасен в плане риверсии и подвергается стабилизации во внеклеточном состоянии. Вакцина из ВГИ предотвращает заболевание и развитие опухолей, но не препятствует инфицированию патогенного вируса, персистированию патогенного и вакцинного вируса и выделению вирулентного вируса во внешнюю среду. Ряд исследователей не установили статистически достоверной разницы между эффективностью сухой и нативной вакцины. Защита привитых цыплят обусловлена сохранением поствакцинальной виремии. Цыплята, у которых обнаруживалась поствакцинальная виремия в ранние сроки, имели более низкий уровень виремии от эпизоотического ВБМ. Cho изучал уровень виремии у цыплят породы белый леггорн линии WSU-VS и C-WH. В сутлчном возрасте подкожно вводили клеточно-связанную вакцину из ВГИ в дозах 240, 1480, 6600 БОЕ. Кур исследовали на наличие вируса с интервалом 3 недели в течение 21 недели. Виремию обнаруживали у всех цыплят линии WSU-VS через 21 неделю, не зависимо от дозы. У цыплят линии C-WH с 9-й недели после вакцинации виремия не выявлялась. При введении 6600 БОЕ средний титр виремии был неизменный в течение 21 недели у цыплят линии WSU-VC с выделением вируса герпеса. Подобные данные со шт. FC-126 получены с использованием теста ВГИ в эпителии перьевых очин.

Кроме того, считают, что ВГИ внедряется в лимфоидные клетки и препятствует внедрению в них патогенного ВБМ. Таким образом, защита кур от ВБМ, обусловленная ВГИ, заключается в снижении уровня виремии от полевого штамма и в предотвращении тем самым гибели птицы.

ВГИ и ВБМ обладают прочной как природной, так и in vitro ассоциацией с клеткой. Сформированные вирионы не покидают клетку, а сохраняют свою биологическую активность при условии структурной целостности вируссодержащих клеток — основы клеточной (нативной жидкой) вакцины. Основа сухой вакцины — стабилизированный внеклеточный вирус ВГИ. Вирионы, высвобожденные от клеток, различаются по уровню морфологической зрелости. ГВИ не способен к горизонтальной передаче в популяции кур. По некоторым данным он слабо эффективен в отношении высоковирулентных вирусов БМ. Предполагается, что многолетняя вакцинация препаратами на основе ВГИ способствует селекции полевых штаммов и выявлению в природе очень вирулентных штаммов БМ, против которых ВГИ неэффективен. В дальнейшем оказалось, что иммуногенность вакцины на основе ВГИ обеспечивается сформированными вирионами и полноценными нуклеокапсидами с максимально плотной упаковкой нуклеоида. В процессе перемежающегося культивирования ВГИ (в культуре клеток и на цыплятах) происходило усиление его репродукции в клетках эпителия перьевых фолликул цыплят при внутримышечном и аэрогенном способах внедрения. На основе реизолятов ВГИ создана новая вакцина против БМ. В последующем она усовершенствована. Как сухая, так и клеточно-ассоциированная вакцина из шт. ВГИ ВНИТИБП в экспериментальных условиях обеспечивала 100 %-ную защиту от большой дозы высокопатогенного штамма ВБМ. В производственных условиях при соблюдении всех правил применения вакцины достигался эффект, близкий к экспериментальному. По морфологии фокусов ЦПД (S-признак) выявлено две группы штаммов ВГИ. S-признак коррелирует с иммуногенностью. Иммуногенную активность вакцины из ГВИ определяют на цыплятах-бройлерах различных пород по методике, разработанной во ВНИТИБП.

Наряду с такими методами, как применение экспериментально и естественно ат-тенуированных штаммов с повышенной иммуногенностью в противоэпизоотичес-кую практику введены две новые категории мероприятий: 1) вакцинация 18-дневных эмбрионов для защиты цыплят от раннего заражения, применение поливалентных вакцин с целью противодействия естественному заражению вариантными штаммами ВБМ, а также использование аэрозольной иммунизации цыплят; 2) применение комплексных (ассоциированных) вакцин против БМ, ИБ и других инфекций. Аэрозольная вакцинация кур ГВИ оказалась также эффективной, как и внутримышечное введение препарата. Вакцинопрофилактика кур против БМ может быть эффективной только при отсутствии вторичных иммунодефицитов. В этом отношении особую ценность представляет инфекционный бурсит птиц, а также инфекционная анемия цыплят. Оказалось, что при одновременном применении живых вакцин против БМ (ВГИ) и ИБ (шт. Люкерта) получен такой же результат, как и при раздельном использовании указанных моновакцин.

При заражении КЭ на 16—28-й день инкубации онкогенные и неонкогенные штаммы ВБМ не проявляли значительной репликации в тканях эмбрионов; вирус оставался неактивным в эмбриональный период до вывода цыплят. Вакцинация эмбрионов ВГИ одновременно с заражением ВБМ дала высокий защитный эффект против БМ, который значительно снижался в случае вакцинации однодневных цыплят. У 17-дневных КЭ, вакцинированных ВГИ, вирус в высоких титрах накапливался только в тканях легкого и практически не обнаруживался в других лимфоидных органах. Клетками-мишенями были фибробластоподобные или эпителиоподобные клетки легких эмбриона, но не лимфоидные или макрофагальные клетки, как это имеет место у цыплят в постэмбриональный период развития. При экстраэмбриональной вакцинации в область мешка на 18,5-й день ВГИ значительно задерживалось развитие поствакцинальной виремии по сравнению с интраэмбриональнои вакцинацией в тело эмбриона и подкожной вакцинацией при вылуплении. Дозы вакцины не влияли на время поствакцинальной виремии. Время поствакцинальной виремии было хорошим индикатором уровня защиты. Внутриэмбриональная вакцинация вызывала значительно большую защиту, чем вакцинация в околоэмбриональное пространство при заражении вирулентным штаммом ВБМ (68—84 %), независимо от дозы вакцины или дня заражения, тогда как уровень защиты при экстраэмбриональной вакцинации был очень низким (0—27 %) и зависел от дозы вакцины и дня заражения.

Поливалентные вакцины против БМ. Наиболее высокие защитные свойства имеют поливалентные вакцины, включающие штаммы группы ВБМ — ВГИ серотипов 1, 2 и 3. Моно-, ой - и поливалентная вакцины защищали соответственно 54,5, 74,5 и 91,5 % цыплят. Бивалентные и трехвалентные вакцины, включающие вакцинные штаммы ВБМ и ВГИ, оказались значительно эффективнее моновакциных, особенно против очень вирулентных полевых штаммов, которые становятся преобладающими в зонах интенсивного птицеводства. In vivo штаммы не интерференцию проявляли, а протек-тивный синергизм: эффективность одного вакцинного компонента возрастала от очень низкой дозы другого и даже частичные дозы двух штаммов были эффективнее полной дозы одного штамма.

Представлены данные о синергизме между шт. FC-126 (серотип 3) hSB-I (серотип 2), между HVT (серотип 3) и 301 В/1 (серотип 2). Использование вакцин, содержащих смесь серотипов 1 и 3 или 1 и 2, обеспечивает меньший уровень синергизма, чем сочетание серотипов 2 и 3. Возникновение в природе высоковирулентных штаммов ВБМ обусловлено способностью герпесвирусов к мутации.

Разработан новый способ производства живой вакцины против БМ. Для этого предложено выращивать ВГИ и ВБМ в перевиваемых культурах клеток рыб, амфибий или рептилий при комнатной температуре в течение 24—48 ч. В этот период вирус в основном находится в клетках, разрушение которых наступает лишь через 72—96 ч. Это позволяет получать вирус в высоком титре и использовать его для получения вакцины. В качестве примера описано культивирование вируса в клеточной линии FHV при 28—32 °С в среде ДД 265424 с уменьшенным содержанием аминокислот и сыворотки. Заметное накопление вируса наблюдалось уже через 18—24 ч, цитолиз наступал на 6—7-й день. Смены среды не требовалось. Сбор вируса проводили на 3—4-й день путем трипсинизации культуры. ВБМ шт. CVI988 серотипа 1 выращивают в культуре клеток RTI-2 радужной форели при температуре 19—24 °С.

Обобщены широкие опыты применения живых вакцин против БМ и сделаны следующие выводы: вакцинация значительно снижает распространение БМ в птицехо-зяйствах, однако заболевание продолжает регистрироваться, так как с помощью вакцинации не удается предотвращать возникновение персистентной суперинфекции и рассеивания вируса. Отмечены также случаи, когда вакцинация не предотвращала вспышек заболевания.

Таким образом, для борьбы с БМ в качестве вакцин используют: 1) аттенуирован-ный вирус серотипа I (HPRS-16). Вакцинированные им птицы не рассеивают его во внешней среде; 2) авирулентный частично аттенуированный вирус серотипа I CVI988, штамм Rispenc). Он имеет остаточную патогенностьдля генетически восприимчивых цыплят, реплицируется in vivo и быстро распространяется; 3) природные не-онкогенные вирусы серотипов 2 (SB-I, 30/В). Используются в бивалентных вакцинах; 4) авирулентный вирус серотипа 3, известный как ВГИ. Это единственный вакцинный вирус, который удается отделить от культуральных клеток и подвергнуть лиофи-лизации; 5) бивалентные вакцины ВГИ + 10—20 % серотипа 2 штамм CVI 988. Обычно рекомендуют дозу, соответствующую 2000 БОЕ; она обеспечивает достаточный эффект даже в присутствии материнских антител. При внутримышечном введении препарата эффект более выражен, чем при подкожном. Наличие виремии вакцинного штамма — свидетельство эффективности вакцинации. Однако корреляция этого признака со степенью защищенности от БМ недостаточно выражена.

Исследования последних лет показали, что наряду с усилением протективного эффекта вакцины из ВГИ серотип 2 ВБМ также увеличивает частоту развития лимфоид-ного лейкоза у птиц, инфицированных ретровирусами. Все семь исследованных штаммов ВБМ серотипа 2 обладали способностью усиливать частоту возникновения лейкоза, лишь некоторые из них теряли эту способность при длительном пассировании в ФЭК. Для повышения эффективности профилактики БМ применяли иммуно-модулятор тимолин.

Все известные вакцинные штаммы стимулируют образование различных AT, перекрестно реагирующих с ВБМ в РДП, РН, ИФ. Появление ПА имеет диагностическое значение. Предполагают, что ведущую роль в защите цыплят от БМ играют ВНА против оболочечных антигенов ВБМ и мембранных вирусспецифических АГ инфицированных клеток. Функциональная роль антивирусных AT может заключаться в нейтрализации свободного от клеток вирулентного ВБМ, и в кооперации с нормальными лимфомами хозяина в лизисе клеток, инфицированных вирусом. Формируются и клеточные иммунные реакции — РГЗТ, цитотоксичность, обусловленная клетками, и антителозависимая цитотоксичность. Функциональная роль клеточных реакций направлена на распознавание и устранение из организма клеток с чужеродной поверхностной структурой за счет вирусных и опухолевых АГ.

Российскими исследователями представлены данные о возможности одновременного введения вируса болезни Марека (ВБМ) и реовируса в составе комбинированной вакцины однодневным цыплятам. Установлено отсутствие достоверных отличий между уровнем поствакцинальных антител к вирусу болезни Марека и реовирусу у цыплят, вакцинированных ассоциированным и моновалентным препаратом. Аналогичные результаты получены при использовании комбинированной вакцины против БМ и ИББ соответственно из штаммов FC-126 и «Био-92».

Выделены два мутанта ВБМ шт. RB1B, обладающие сниженной онкогенностью и горизонтальной передачей. Один мутант RBIBgCgptlac имел ксантин-гуанин-фос-форибозил трансферазу Escherichia coli и lacZ гены, внедренные в гликопротеин С. Мутант не мог продуцировать gC-специфический транскрипт 1,8 т. п.о., который присутствовал в фибробластах КЭ, инфицированных RB1B. Случаев опухолей, у цыплят, инфицированных этим мутантом было значительно меньше, чем у цыплят инокулированных родительским вирусом. Цыплята не давали опухолей при контактах с мутантом, а второй мутант, RBlBmeqlac имел lacZ, внедренный в сайт внутри meq-кодирующего участка с большой делецией. Мутант не индуцировал опухоли у цыплят, экспонированных к нему или инокуляцией или контактом.

Генноинженерные вакцины. Сконструирован рекомбинантный вирус оспы птиц (ВОП), экспрессирующий гликопротеин I вируса болезни Марека. Рекомбинантный вирус способность реплицироваться после 20 пассажей при заражении CEF. Методом иммунофлуоресценции показано, что сыворотка цыплят, иммунизированных реком-бинантным вирусом, выявляет зараженные ВБМ клетки. Секвенирован сегмент ДНК ВБМ, содержащий гены гликопротеинов gD, gl и gE. Эта ДНК может быть использована в качестве зонда для обнаружения ДНК ВБМ, а также для экспрессии гликопротеинов gD, gl и gE с целью продукции антител к ним. Гены gl и gE могут служить потенциальными сайтами вставки чужеродных генов в геном ВБМ и могут быть использованы для аттенуации полевых изолятов ВБМ. Сконструированы рекомбинанты вируса птичьей оспы и ВГИ, экспрессирующие антигены ВБМ. Гликопротеин В MDV серотипа 1 (gBl) является эффективным иммуногеном, который особенно важен для создания защитного иммунитета в генетически чувствительных цыплятах. Однако материнские антитела против MDV снижали эффективность вакцинации рекомби-HaHTHoftgBl вакциной. Были сконструированы рекомбинанты, экспрессирующие антигены ВБМ и ВНЕ, которые оказались эффективными в предотвращении болезни Марека и системной нъюкаслской болезни. Материнские антитела не снижали значительно эффективность вакцинации рекомбинантами ВГИ. Дискуссируются новые подходы к вакцинации против весьма вирулентных штаммов MDV.

Сконструирована нуклеотидная последовательность сегмента ДНК ВБМ, кодирующего гликопротеиды gD, gl и gE. Последовательность может быть использована в качестве зондов для обнаружения ДНК герпесвируса, для экспрессии гликопротеи-дов с целью использования их при продукции антител, специфически узнающих указанные выше антигены. Два последних гена могут быть также потенциальными сайтами для встраивания чужеродных генов и, вероятно, сайтами инактивации при атте-нуации полевых изолятов ВБМ с целью получения вакцины. Гликопротеины gB, gD ВБМ штамм Gt экспрессировали соответственно в бакуловирусной системе и в клетках E. coli. Получены мАТ к gB, с помощью которых показано, что gB спсобен к адгезии на поверхности лимфоцитов цыпленка и защищает цыплят от острой БМ, но не от последующего онкогенеза. С использованием мАТ к gD показано, 4TOgD расположен в фоликулах перьев цыплят, зараженных ВБМ. Установлено, что экспрессия одного gD не влияет на ассоциацию ВБМ с фибробластами эмбриона цыпленка. Методом ПЦР амплифицировали гомолог гена рр38 из геномной ДНК фибробластов эмбриона цыпленка, зараженных штаммом CV1 988/С ВБМ, встроили в вектор pUC18, а затем в бакуловирусный переносящий вектор рВас РАК8. ДНК рекомбинантного вектора ВМ-Вас РАК6, расщипленную рестрикционной эндонуклеазой Cynl, кон-трасфицировали с вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП) Bombyx mori в клетки шелковичного червя и выделили рекомбинантный ВЯП, экспрессирующий рр38 в плазматической мембране и цитоплазме клеток В. Mori. Рекомбинанты предложено использовать ВБМ, у которых чужеродная ДНК встроена в ген UL54.5 под контролем активного герпесвирусного промотора для продукции антигенных белков, например белков VP1, VP3 , VP4 вируса ИББ, niHKonpoTeHHOBgB, gA, gD ВБМ, белков F HN ВНБ, белков шипов, нуклеокапсида и матрикса вируса ИБ.

Инактивированные вакцины. Инактивированные вакцины получены из цельного вируса различной степени очистки с добавлением разных инактивантов и адъюван-тов. Можно получить иммуногенные препараты, не содержащие нуклеиновую кислоту, но имеющие соответствующие протеины. Препараты клеточных мембран, зараженных ВГИ клеток, эмульгированных с адъювантом Фрейнда, оказались высокоим-муногенными в отношении патогенных штаммов ВБМ. Иммунизация кур растворимыми АГ, экстрагированными из клеток, зараженных аттенуированным штаммом ВБМ, снижала заболеваемость птицы в 2—5 раз. Видимо, гликопротеины, экстрагированные из клеточных мембран зараженных клеток, могут быть эффективными препаратами.

БМ примечательна тем, что является первым примером опухолеродного заболевания вирусной этиологии, против которого успешно применяется вакцинация. Однако трудности практического применения аттенуированных клеточносвязанных вакцин против этой инфекции привели к необходимости разработки новых средств профилактики. Одним из наиболее перспективных направлений является создание ре-комбинантных вирусных вакцин, экспрессирующих антиген ВБМ. Уже в 1992 г. Nazerian et al. создали рекомбинантный вирус оспы кур (rFPV) который экспрессиро-вал gB-ген ВБМ. Посттрансляционная модификация продукта этого гена (gB) в клетках, инфицированных rFPV, сходна с посттрансляционной модификацией в инфицированных клетках. Выявлена способность rFPV-gB индуцировать ВНА AT к ВБМ, уменьшать уровень клеточноассоциированной ВБМ-виремии у вакцинированных цыплят, предотвращать развитие опухолей и смерть от БМ при заражении высокопатогенным штаммом ВБМ. Выявлена область ДНК ВБМ типа 1, в которую могут быть встроены гибридные гены без влияния на репликацию вируса. Создан рекомбинант ВБМ на основе иммуногена другого возбудителя болезни домашней птицы. При вакцинации здоровых птиц они приобретали иммунитет к двум возбудителям.

Сконструирован делеционный мутант GAD4,8 lac ВБМ, у которого 4,8 тыс. п. н. в области US заменены геном lacZ E. coli. Эта делеция удалила гены ВБМ, аналогичные генам US 1, US 10 и US2 ВГИ, и специфичные для ВБМ короткие открытые рамки считывания Sorfl, Sorf2, SorO. Изучены также мутанты ВБМ со вставками lacZ в гены US1, US10 или US2. Жизнеспособность сконструированных мутантов показала, что эти гены не нужны для роста ВБМ в фибробластах КЭ. На ранней стадии заражения кинетика роста этих мутантов такая же как и у ВБМ дикого типа, но через 5—7 дней рост мутантов замедляется в 5—10 раз. На монослоях перевиваемых ФЭК эффективность посева ниже, чем на монослоях первичных ФЭК. После инокуляции цыплятам мутант может быть реизолирован, так что делетированные гены не нужны для заражения цыплят.

Сконструирован также рекомбинантный бакуловирус, геном которого содержит ДНК, кодирующую гликопротеины Д ВБМ 1-го серотипа. Патентуется использование рекомбинантного вируса оспы птиц в качестве вакцины против БМ. Он содержит гены, соответствующие одному или нескольким антигенам ВБМ, таким как глико-протеиды В, С, Д и Н, а также оболочечным белкам. Патентуется и другой способ создания новых вакцин против БМ, который основан на изучении последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуногенные полипептиды 18 и 20 ВБМ.

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. В настоящее время накопилось много данных, свидетельствующих в пользу гипотезы двухступенчатого вакцинального иммунитета при БМ. На 1-й ступени он направлен против вирусных АГ, на 2-й — против опухолевых клеток — носителей поверхностного опухолеассоцииро-ванного АГ. Для оценки иммунного ответа при БМ в лабораторных условиях может быть широко использован тест задержки миграции лейкоцитов.

Отмечена тесная корреляция между наличием вирусспецифических преципити-нов у вакцинированных птиц и их смертностью после интраперитонеального заражения вирулентным шт. Md-11. Однако высказано и противоположное мнение: наличие специфических AT не коррелирует с восприимчивостью птицы, не препятствует развитию вирусемии и не обеспечивает устойчивости к заражению, а пассивно приобретенные материнские антитела практически не защищают цыплят от заражения и заболевания и даже препятствуют иммунному ответу на вакцинацию цыплят. Так, у цыплят с высоким исходным уровнем материнских AT титр ВНА начинает нарастать спустя 4—5 недель после вакцинации, в то время, как вакцинация у цыплят, негативных в отношении материнских AT, ведет к прогрессирующему нарастанию уровня ВНА, начиная с 2-й недели (средний уровень AT 6,4 к 35-дневному возрасту).

Клеточно-свободный вирус более чувствителен к материнским AT, чем клеточно-связанный. Клеточный иммунитет играет основную роль в резистентности к БМ. Он является клеточным противоопухолевым иммунитетом и обусловлен накоплением в крови инфицированных птиц Т-лимфоцитов, токсичных для лимфобластоидных клеток. Напряженность Т-клеточного иммунитета организма можно оценивать по кожнореактивному фактору (КРФ), индуцируемому фитогемаглютинином (ФГА), который вызывает трансформацию и деление лимфоцитов, причем, ФГА индуцирует различную степень выраженности КРФ в зависимости от напряженности клеточного иммунитета у вакцинированной птицы. КРФ — простая, удобная и достаточно информативная модель для оценки клеточного иммунитета. Возрастная резистентность к БМ развивается в период 4-8-й недели жизни и ее уровень примерно в 1О4 выше в этом возрасте, чем у суточных цыплят. Переболевшие птицы остаются носителями вируса на всю жизнь. Они вырабатывают AT и передают их через желток цыплятам. Присутствие материнских AT у новорожденных цыплят не предотвращает заражения, но слегка задерживает последующее развитие поражений.

Частота заболеваемости тесно коррелирует с динамикой образования ядерных включений. Образование же последних тесно связано с поражением нервов. У цыплят, вакцинированных вирусом ВГИ (FC-126), при последующем заражении их ВБМ отмечается заметное ограничение появления ядерных включений и самой БМ в стаде. Эти данные могут быть ценными при быстрой и простой оценке вакцины против БМ. Наличие вакцинальной виремии является одним из показателей иммуногеннос-ти живых вирус-вакцин, интенсивность и длительность проявления виремии свидетельствуют о жизнеспособности вируса в вакцине. Вирус и активно приобретенные антитела персистируют в течение 18 месяцев.

Для определения различий в уровне экспрессии между устойчивыми и чувствительными инбредными линиями цыплят использовалась ПЦР, которая селективно амплифицировала участок гена ICP4 вируса болезни Марека. Метод применялся к вакцинному вирусу Rispens и герпесвирусу индюшек (HVT). Наблюдались значительные различия в уровнях репликации вакцинных штаммов вируса и патогенных штаммов в вакцинированных птицах. Высокий уровень экспрессии HVT наблюдался в линии цыплят, которые впоследствии имели низкие уровни патогенного вируса и наоборот. Вакцинный штамм Rispens давал высокий уровень экспрессии в цыплятах, характеризовавшихся и увеличенным уровнем экспрессии патогенного вируса. Анализ показал, что количество вируса внутри клеток оказалось сходным в устойчивых и чувствительных линиях.


Болезнь Марека - 5.0 out of 5 based on 2 votes

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить