Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 4.50 (1 Голос)

Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КРС) широко распространен во многих регионах России.

Общепринятые методы диагностики этой болезни (выделение вируса в культуре клеток, реакция нейтрализации и др.) не всегда результативны при острых вспышках. Если ИРТ протекает латентно, то обнаружить вирус этими способами практически невозможно. Существуют также технические трудности при изоляции вируса из патологического материала на ранних стадиях инфекции, при осложненных формах болезни и особенно при выявлении вируса в сперме быков-производителей.

Латентная форма обычно бывает после первичного острого переболевания животного инфекционным ринотрахеитом. При этом вирус находится в организме в скрытом состоянии (латенции) под постоянным контролем иммунной системы. Длительность вирусоносительства не ограничена во времени, однако определенные эндо-и экзогенные факторы, подавляя контроль со стороны иммунной системы, периодически могут вызывать реактивацию виру реактивироваться спонтанно, не теряя при этом патогенности для «чистых» животных [5].

Феномен латенции у ИРТ КРС приводит к неконтролируемому распространению инфекции. Особенно опасны в этом плане быки-производители, у которых болезнь чаще всего протекает в латентной форме [2, 4, 5, 7, 8].

Ранняя диагностика, а также своевременное выявление скрытых вирусо-носителей являются важным фактором в оздоровлении хозяйств от ИРТ КРС и недопущении распространения инфекции.

Цель нашей работы — изучить эффективность разработанной нами тест-системы для диагностики ИРТ КРС [1].

Основным компонентом тест-системы является однонитиевой ДНК-зонд, меченный биотипом (нерадиоактивной меткой) путем химической модификации ДНК по цитозиновым звеньям.

Материалы и методы. Исследования провели в 1990—1995 годах в лаборатории вирусологии ИЭВСиДВ, лаборатории генной диагностики НИИ биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор», совхозах Новосибирской, Кемеровской областей, Алтайского, Красноярского краев, а также в головных племобъе-динениях Новосибирской, Омской и Томской областей.

При этом использовали культураль-ные вирусы: штамм ТК-А вируса ИРТ КРС, штамм Мовар-33/63 вируса герпеса крупного рогатого скота 4-го типа, штамм ВК аденовируса крупного рогатого скота 1-го типа, штамм Филавиа вируса болезни Ауески, ДНК клеток почки теленка (МДВК), в которых репродуцировали указанные возбудители и ДНК тимуса теленка в препаративных количествах.

Вирусологические и серологические исследования проводили по общепринятым методикам.

Для выделения ДНК из исследованных проб к образцу спермы, суспензии органов добавляли протеиназу К до концентрации 0,1 мг/мл в буфере: 0,01 М трис-НС! (рН 8,0), 1 мМ ЭТДА, 0,15 М МаС1, 1 % 808 и инкубировали 2 ч при 37 *С. Затем ДНК депротеини-зировали фенолом и хлороформом. Гибрущизацию ДНК-зонда с вирусными ДНК проводили на капроновых фильтрах Амершам в растворе 6x350, 5хДенхардт, 0,5 % 808, 100 мкг/мл

Таблица 1

Сравнительное изучение методов выявления вируса ИРГ при респираторных болезнях

   

Выявлено положительных Проб методом

 

ИсслеДовано Проб

Моле-

   

Форма болезни

КулярНой Гибри-

Виру-со-Логиче-

Серо-Логиче-

   

Диза-

Ским

 
   

Ции

   

Не Исследовали

Острая ослож-

12

6

2

То же

Ненная

     

\

Хроническая

45

17

0

15

ОРЗ невыяс-

42

0

0

Не

Ненной этио-

     

Исследовали

Логии

       

Денатурированной ДНК спермы лосося при температуре 60 С в течение 16 ч. После трехкратной отмывки фильтров Последовательно в растворах 2х83С, 0,1% 808 и 0,2x880, 0,1% 808 Выявляли биотиновые группы на фильтрах с помощью конъюгата стреп-тавидина с щелочной фосфатазой и Красителей [6]. Контролями служили ДНК вируса герпеса 4-го типа, ДНК Аденовируса 1-го типа и ДНК вируса Болезни Ауески.

Образцы биоматериала исследовали параллельно вирусологически в культуРе клеток МДВК методом молекулярНой гибридизации и выборочно сероЛогически.

Для работы отобрали 103 пробы Патологического материала от телят, больных осложненными и неосложненными респираторными болезнями, а также 374 пробы спермы от быков-производителей (128 из них предостаВил нам заведующий отделом вирусоЛогии Новосибирской областной ветла-Боратории В. И. Аксенов).

Результаты исследований. ЧувствиТельность выявления вирусной нуклео-тидной последовательности вируса ИРТ КРС с помощью биотинилирован-Ного ДНК-зонда составила 10 пико-

Са и его выделение во внешнюю среду. Вир грамм. Зонд специфичен к ДНК вируса.

С помощью метода молекулярной гибридизации выявили значительно больше положительных проб от животных с разными формами респираторНых болезней, что, вероятно, указывает на его преимущество по сравнению С вирусологическим. Так, при острой Форме болезни первым методом обнаружили 2 положительные пробы, а вторым — 1; при острой осложненной форме — соответственно 6 и 2 пробы (табл. 1).

Результаты молекулярной гибридизаЦии коррелировали с данными серологических исследований при хронической форме болезни. С помощью Первого метода выявили ДНК вируса в 17 пробах, а реакция нейтрализации была положительной в 15. Данные вирусологических исследований были Отрицательными. По-видимому, это Связано с латентным состоянием вируСа в организме этих животных.

При эпизоотологическом обследоваНии хозяйств с респираторными боЛезнями невыясненной этиологии (42 Пробы) результаты молекулярной гибридизации и вирусовыделения во всех пробах были отрицательными. ЗаболеВания телят в этих случаях вызывали Патогенные агенты микробной этиолоГии, что подтвердили бактериологическими исследованиями.

Из 290 проб спермы быков-производителей Новосибирского племобъедиНения ДНК вируса присутствовала в 102 пробах, из 77 проб Омского племобъединения — в 14; и из 7 проб Томского — в 4. Эти данные свидетельствуют о широком распространеНии ИРТ КРС среди животных указанных племобъединений и о большей чувствительности метода молекулярной Гибридизации по сравнению с выделеНием вируса в культуре клеток. Результаты молекулярной гибридизации Коррелировали с таковыми серологиЧеских исследований (табл. 2).

При вирусологическом исследовании только одна проба спермы дала положительный результат. Это объясняется, по-видимому, низким содержанием вируса в сперме и недостаточной чувствительностью культуры клеток.

Известно, что вакцинация не всегда предотвращает скрытое вирусоносительствс полевого штамма, однако сокращает количество (частоту) рецидивов [5, 8]. В связи с этим мы поставили производственный опыт: 18 быков, у которых ранее обнаружили ДНК вируса и серологические реакции были положительными, двукратно с двухнедельным интервалом иммунизировали вакциной против ИРТ КРС согласно наставлению. Пробы спермы и сыворотки крови исследовали тремя методами до вакцинации и через месяц после нее (табл. 3).

При исследовании проб спермы быков стандартным вирусологическим методом положительный результат дала только одна проба, а молекулярная гибридизация выявила ДНК в семи парных пробах (№ 2, 3, 9, 13, 15, 16, 17). Это свидетельствует о том, что вакцинация не предотвращала полностью контаминацию спермы вирусом, его регистрировали в пробах как до, так и после вакцинации (7 проб), несмотря на высокие титры антител. У 11 быков из 18 в сперме до и через месяц после вакцинации ДНК вируса не обнаружили, однако спустя 2 мес ее вновь выявили в сперме этих быков.

По-видимому, вакцинация частично сдерживает выход вируса из латентного состояния на определенный период; Мы считаем, что это зависит от напряженности иммунитета у животных и, как следствие, усиления контроля со стороны иммунной системы макроорганизма. Наши результаты согласу-. ются с данными отечественных и зарубежных авторов [3—5, 7, 8].

Определенные эццо - и экзогенные факторы (стрессы) вызывают реактивацию вируса из латентного состояния и выделение его во внешнюю среду. Для установления частоты реактивации вируса в естественных условиях у быков-производителей мы в 1992— 1993 годах исследовали сперму от одних и тех же животных с интервалом 1—15 мес. При этом все быки Реагировали положительно серологически (титры антител в реакции нейтрализации составляли 1:4—1:16), а результаты вирусовыделения были отрицательными.

Определенной закономерности в Частоте реактивации вируса мы не обнаружили (табл. 4). В течение Определенного периода времени вирус выявляли не во всех пробах спермы быков-вирусоносителей. При исследовании спермы методом молекулярной гибридизации необходимо выбраковывать контаминированные вирусом серии, а «чистые» использовать для осеменения коров.

Заключение. Молекулярная гибриДизация с применением гибридизациОнной тест-системы для диагностики ИРТ КРС является высокочувствительНым и специфичным методом. ЧувстВительность выявления вирусной ДНК Составляет 10 пикограмм, при этом Зонд гибридизуется только с ДНК Вируса ИРТ КРС.

В экспериментальных и производстВенных условиях результаты молекуЛярной гибридизации превосходят таковые стандартных вирусологических методик по чувствительности и срокам обнаружения вируса. Полное время анализа патологического материала из любого источника составляет около суток.

Метод прост по технике выполнения, информативен, экономически целесообразен и позволяет выявлять ДНК

Вируса в любом биологическом материале. При его использовании можно обнаружить латентных вирусоноситеЛей, опасных в эпизоотологическом Плане, и дать оценку спермы быков-производителей, что имеет большое экономическое значение.

 

А. Г. ГЛОТОВ

ИЭВ Сибири И Дальнего Востока

С, Ф. ОРЕШКОВА

НИИ биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор»


Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации - 4.0 out of 5 based on 1 vote

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить