Определение билирубина в сыворотке крови

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 4.75 (2 Голоса)

В незначительном количестве билирубин может быть обнаружен в сыворотке крови у здоровой лошади. В значительных количествах билирубин появляется только при патологических процессах.

Билирубин образуется из гемоглобина распавшихся эритроцитов. В результате распада образуется два пигмента—гемосидерин, содержащий железо, и гематорфирин. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы из этих пигментов образуется билирубин, связанный с глобулинами. Этот билирубин некоторое время циркулирует в крови, окрашивая сыворотку в желтоватый цвет. Затем он захватывается купферовскими клетками печени и свобождается от белка, после чего становится полноценным билирубином, который поступает в кишечник. Часть пигмента в виде уробилина всасывается в кровь, а часть в виде стеркобилина выводится с фекалием.

При патологии возможно скопление чистого билирубина в крови и выведение его через почки с мочой. Следует отметить, что билирубин, связанный с белком, через здоровые почки не проходит, но его выделение возможно при нефритах.

Билирубин, связанный с белком, называется билирубином, не проведенным через печень. Повышенное количество такого билирубина в крови отмечается при гемолитических желтухах. Чем значительнее гемолиз эритроцитов, тем больше содержится в сыворотке крови билирубина, не проведенного через печень.

Билирубин, не связанный с глобулинами, называется проведенным через печень. Значительное количество такого билирубина в сыворотке крови можно обнаружить при различного рода препятствиях к оттоку желчи в кишечник. Желчь застаивается в выходящих путях и затем начинает поступать в кровь.

Определение билирубина в сыворотке крови является, следовательно, надежным методом дифференциации желтух.

Ван-ден-Берг, разработавший метод дифференциации желтух, различает два вида реакции на билирубин: прямую и непрямую.

Прямой реакцией называется такая, которая возникает после добавления рабочего реактива. Окрашивание жидкости может иметь вариации по времени и интенсивности окраски. Различают реакции прямую, быструю или моментальную, когда жидкость окрашивается сейчас же после добавления реактива; прямую двухфазную, если после добавления реактива жидкость окрашивается очень слабо, а затем окрашивание становится все более и более интенсивным, и прямую замедленную, когда окрашивание появляется спустя 10—15 минут. Прямая реакция получается при наличии в крови билирубина, проведенного через печень. Прямая, быстрая реакция отмечается при механической желтухе, возникающей при закупорке желчного протока камнями, паразитами.

Прямая двухфазная реакция бывает при желтухах смешанного характера, а прямая замедленная—при катаральное желтухе с нарушением функции печеночных клеток.

Непрямая реакция возникает после добавления спирта. Она выявляет билирубин, не проведенный через печень и связанный с глобулиновой фракцией. Спирт коагулирует белок и тем самым разрушает связь билирубина с глобулинами и создает нормальные условия для хода реакции.

Непрямая реакция указывает на гемолитическую желтуху, когда билирубина бывает больше 3 мг% в 100 мл сыворотки крови.

Для определения билирубина в сыворотке крови рекомендуется несколько методов. По точности результатов на первом месте стоит колориметрический метод Ван-ден-Берга. Он применяется чаще при выполнении научных работ, так как требует лабораторных условий, химически чистых реактивов и колориметра Аутенрита или Дюбоска. В клинической практике используются другие методы, например Бакальчука и Херцфельда. Для ориентировочных исследований может быть использован метод Мауленграхта в модификации Синева для животных.

Способ Ван-ден-Берга. Для постановки реакции необходимо иметь колориметр Аутенрита или Дюбоска, диазореактивы Эрлиха, 96%-ный спирт и стандартный раствор.

Рабочая смесь готовится из разных диазореактивов. Первый реактив— сульфаниловой кислоты 1,0, соляной кислоты 15 мл (уд. вес 1,125) и дистиллированной воды 1 литр. Второй—азотистокислого натрия 0,5 и дистиллированной воды 100 мл. Рабочий реактив готовится в соотношении 8 мл первого реактива и 0,25 мл второго.

Наилучшим и наиболее употребительным является кобальтовый стандарт. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2,161 г сернокислого кобальта, предварительно освобожденного от кристаллизационной воды путем нагревания. Можно также взять 3,92 г кристаллического CoS04*7H20. Этот раствор соответствует раствору билирубина 1:200 000 (0,5 мг%).

Раствором такой же окраски, но менее стойким, является раствор, полученный следующим образом: 1) в колбочке емкостью в 100 мл, растворяют 0,1508 железо-аммиачных квасцов в небольшом количестве воды, прибавляют затем 50 мл соляной кислоты (удельный вес 1,19) и доводят после этого водой уровень жидкости до метки 100. Из этого основного раствора, имеющего 1/320 нормальности, приготовляют рабочий реактив (1/8000). В колбу емкостью 250 мл вносят 10 мл основного раствора, смешивают с 25 мл соляной кислоты и доливают до 250 мл водой. Рабочий реактив годен для работы в течение нескольких месяцев; 2) 10%-ный раствор роданистого калия или аммония.

Приготовление стандартного раствора. К 3 мл рабочего реактива прибавляется в делительной воронке 3 мл 10%-ного раствора роданистого калия и 12 мл сернокислого эфира. При постоянном охлаждении делительной воронки под краном, жидкость смешивают до тех пор, пока роданистое железо не будет экстрагировано эфиром. Этим розовым эфирным раствором роданистого железа и пользуются для сравнения в качестве стандарта. Раствор нужно предохранять от испарения. По своей окраске стандарт соответствует 0,5 мг билирубина на 100 мл сыворотки крсви.

Техника исследования сводится к следующему: К 2 мл испытуемой сыворотки добавляют 4 мл спирта и смесь центрифугируют в течение 20 минут; 1 мл раствора переносят в клин колориметра Аутенрита или стаканчик колориметра Дюбоска и прибавляют 0,5 мл рабочего реактива.

Наполнив затем второй стаканчик колориметра кобальтовым стандартом или раствором роданистого железа, сравнивают окраску обоих растворов и устанавливают, на каких делениях шкалы получается идентичное окрашивание в обоих стаканчиках. Расчет производится по формуле:

С2= C2*H2*5 / H1 мг в 100 мл сыворотки.

C1—концентрация исследуемой жидкости;

С2—концентрация стандартного раствора;

Н1—высота столба исследуемой жидкости;

H2—высота стандарта.

При расчетах необходимо учитывать степень разведения сыворотки.

При наличии билирубина получается розовое окрашивание, но нужно учесть что окрашивание зависит от реакции среды. В нейтральной среде окрашивание получается розовое, в слабокислой—эта окраска имеет слабосиневато-фиолетовый оттенок. Такая же окраска получается и при медленном проведении пробы.

Метод Бакальчука. Для постановки пробы используются диа-зореактивы (см. метод Ван-ден-Берга), из которых готовится рабочая смесь в пропорции: 10 мл реактива № 1 и 0,3 мл реактива № 2.

Для определения билирубина берется пять пробирок; в них наливают по 0,5 мл физиологического раствора, а затем в первую вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки. Перемешав жидкость, отсасывают при помощи пипетки 0,5 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Из второй после перемешивания смеси переносят 0,5 мл в третью и т. д. Излишек в пятой пробирке отсасывается и выливается в чашку. В результате получается разведение кратное 2, 4, 8, 16, 32.

В каждую из пробирок вносят затем по 0,5 рабочего реактива и осторожно смешивают. При наличии билирубина получается розовое окрашивание. Концом реакции считается разведение, в котором едва различимо розовое окрашивание.

Если окрашивание не наступило в течение 15 минут, в пробирки добавляют спирт. Помутневшая вследствие осаждения белка жидкость при наличии билирубина окрашивается в розовато-малиновый цвет. Чтобы лучше заметить в мутной жидкости изменение цвета, рекомендуется добавить по 0,5 мл эфира и рассматривать на белом фоне. Разница между бесцветным слоем эфира и окрашенной испытуемой жидкостью выступает очень отчетливо. Умножив разведение на 0,016, устанавливают количество билирубина в 1 мл. Умножением на 100 получают количество билирубина в миллиграммах на 100 мл сыворотки.

Методом Бакальчука можно определить, кроме количества билирубина, разновидность его. Появление окрашивания после добавления рабочего реактива говорит в пользу билирубина, проведенного через печень (прямая реакция) изменение цвета после добавления спирта свидетельствует о наличии билирубина, не проведенного через печень (непрямая реакция).

Метод Херцфельда. В качестве реактива используется смесь 19 частей 25%-ной соляной кислоты и 1 часть 25%-ной азотной кислоты. Этот основной раствор отличается стойкостью и хорошо сохраняется в продолжение длительного времени.

Перед постановкой опыта каждый раз готовят рабочий реактив, состоящий из 1 части реактива и 4 частей 96° спирта.

Для определения билирубина берут шесть пробирок. В первую пробирку наливают 1 мл испытуемой сыворотки, а в остальные пять—по 0,5 мл физиологического раствора. Затем 0,5 мл сыворотки из первой пробирки переносят во вторую. Перемешав жидкость, отстаивают 0,5 мм смеси и переносят в третью и т. д. Излишек в 0,5 мл в последней пробирке отстаивается и удаляется, Приготовив таким образом ряд разведений, в каждую пробирку вносят по 0,5 мл рабочего реактива.

При наличии билирубина получается окрашивание жидкости в зеленый цвет, который постепенно теряет свою интенсивность по мере разведения сыворотки. Конечная реакция дает еле заметное зеленое окрашивание. Умножая степень разведения на 0,016, получают количество билирубина в 1 мл сыворотки.

Метод Синева. Стандарт Синева (двухромовокислый калий 0,1, серная кислота 3,0 и дистиллированная вода 200,0), соответствующий по своей окраске слабожелтому оттенку сыворотки лошади, принимается за единицу. Исследование производится в штативе. Рядом с пробиркой, содержащей стандарт, помещается пробирка с 0,5 мл испытуемой сыворотки. Затем при помощи градуированной пипетки в испытуемую сыворотку добавляют по 0,5 мл 30%-ного раствора поваренной соли до тех пор, пока окраска не будет соответствовать цвету стандарта. Количество билирубина определяется по формуле: 0,5 +Х=Количеству билирубиновых единиц. В нормальной сыворотке цвет соответствует стандарту и не требует разведения, а потому количество билирубина по этой формуле будет равняться 0,5+0,5=1,0.

Количество билирубина в сыворотке крови здоровой лошади (в мг на 100 мл), определенное колориметрическим методом, по данным отдельных авторов, колеблется в следующих пределах.

По Хрусталеву 0,37—3,0, среднее 1,09;
по Синеву 0,3 —1,0, среднее 0,8;

По Симонову 0,19—1,09, среднее — 0,64.

Содержание билирубина в сыворотке значительно повышается при инфлюэнце, крупозной и гриппозной пневмонии, мыте и некоторых других заболеваниях.

Наиболее высокие цифры отмечаются при кровепятнистой болезни, отравлении S02 и хвощом, когда количество билирубина повышается до 4 мг. Максимальные изменения обнаружены при энцефаломиэлите лошадей (8—12 мг на 100 мл сыворотки).

Значительные билирубинемии отмечаются при большом количестве заболеваний, имеющих совершенно различную клиническую картину, а потому могут быть с успехом использованы в дифференциации процессов и для прогноза.


Определение билирубина в сыворотке крови - 4.5 out of 5 based on 2 votes