Методика контрастирования (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и Эозином (г.-э)

1) Парафиновые срезы, наклеенные на предметное стекло, освобождают от парафина (депарафинируют) поочередно погружая их в 2 порции ксилола (толуола, бензола) - по 3 мин.

2) Проводят гидратацию срезов путем поэтапного погружения их в спирты убывающей концентрации (96°, 80°, 60°, 40°, а затем в дистиллирующую воду на 3-4 мин.

3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (щелочного) красителя - гематоксилина - в течение 2 мин.

4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затем полощут в дистиллировной воде.

5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - эозина - в течение 0,5-1 мин.

6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.

7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их погружают в спирты возрастающей концентрации - поочередно в спирты 40°, 60°, 80°, 96°, и 100° - по 1-2 мин.

8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем - в двух порциях ксилола - по 2 мин.

9) Заключение срезов: на срез стеклянной палочкой наносят маленькую каплю раствора канадского бальзама (полистирола, дамар-лака и др.) и накрывают обезжиренным покровным стеклом, осторожно опуская его под углом, стараясь избежать попадания пузырьков воздуха. Сверху можно поместить небольшой груз для удаления избытка бальзама (полистирола).

Оценка результатов окрашивания

Гематоксилин является щелочным (основным) красителем. Он окрашивает структуры клеток и тканей, имеющие кислую среду, например, ДНК и РНК в ядрах клеток, кислые гликозаминогликаны в межклеточном веществе соединительной ткани. Поэтому такие структуры называют базофильными (от лат. basis - основа). В окрашенном гематоксилином микропрепарате ядра клеток будут темно-синими или темно-фиолетовыми.

Эозин (от греч. заря) имеет красный или розовый цвет и является кислым красителем. Щелочные компоненты клеток или неклеточные структуры, которые окрашиваются этим красителем, называют оксифильными, или ацидофильными (от греч. Oxy или лат. Acidum - кислота), или эозинофильными.

Следует учесть, что цитоплазма разных клеток может окрашиваться как базофильно, так и эозинофильно. Например, клетки, которые активно синтезируют белковые компоненты, содержат в цитоплазме большое количество рибосом (а, следовательно, и РНК), поэтому их цитоплазма окрашивается базофильно. Если структуры цитоплазмы окрашиваются одновременно и щелочными, и кислыми красителями, то они называются нейтрофильными, или гетерофильными.

Имеется целый ряд красителей, например тиазинового ряда (азур, толуидиновый синий, метиленовый синий и др.), которые при взаимодействии с компонентами клеток и тканей изменяют свой цвет на несвойственный им (синий на красный или фиолетовый; черный на желтый или зеленый и т. п.). Такое явление получило название метахромазия.

При соблюдении правил приготовления микропрепаратов и применении стойких красителей постоянные микропрепараты могут храниться десятилетиями, не теряя своих первоначальных качеств.

Следует помнить, что ядерные и цитоплазменные красители обычно связываются с окрашиваемыми структурами в количествах, пропорциональных содержанию в них реагирующих компонентов. На этом основана количественная цито- и гистохимия.